不同产地灵芝子实体化学成分及抗氧化活性研究

摘要

灵芝是一种珍贵的药、食两用真菌，具有补中益气、滋补强体、延年益寿等功效。灵芝多糖是灵芝的主要活性成分，具有抗氧化、抗衰老和调节机体免疫等多种生物活性。本文对不同产地灵芝子实体的化学成分及其粗多糖的体外抗氧化活性进行了对比分析，研究了灵芝子实体多糖的提取工艺、分离纯化及理化性质，主要研究结果如下:
　　(1)通过对不同产地灵芝子实体的化学成分进行测定，结果表明:安徽1号样的碳水化合物含量、能量、锗含量、蛋白质含量、氨基酸总量、必需氨基酸总量、不饱和脂肪酸所占比例、灵芝酸A、B总含量都高于吉林1号样和吉林2号样两种灵芝子实体。
　　(2)采用ABTS自由基清除法、DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法和铁氰化钾法4种方法，分别对3种不同产地灵芝子实体（安徽1号样、吉林1号样、吉林2号样）粗多糖和1种灵芝菌丝体胞外粗多糖的体外抗氧化活性进行评价。结果表明:四种粗多糖均具有抗氧化能力。安徽1号样粗多糖对ABTS自由基、DPPH自由基的清除能力最强，其对应EC50值分别为1.50 mg·mL-1和2.09 mg·mL-1;相同浓度下安徽1号样粗多糖的还原力最强;灵芝菌丝体胞外粗多糖对羟基自由基的清除能力最强，其EC50值是1.29 mg·mL-1。由此可见，四种粗多糖的抗氧化活性不同，其中安徽1号样粗多糖的综合抗氧化活性最强。
　　(3)通过单因素实验和响应面优化，得出安徽1号样多糖的最佳提取工艺条件为:提取温度为100℃，液料比为21 mL/g，提取时间为2.5h，提取次数为3次。在此最佳工艺条件下，多糖得率为1.54±0.04％，该值接近预测值1.52％，说明试验结果与模型符合程度良好。
　　(4)安徽1号样粗多糖经DEAE-650离子交换树脂和葡聚糖凝胶G-100树脂的分离纯化，得到三种纯化多糖组分GLP-1、GLP-2、GLP-3。对GLP-1、GLP-2、GLP-3进一步研究发现其红外光谱扫描、紫外光谱扫描和基本理化性质都具备多糖类化合物的一般特征。HPLC柱前衍生化分析其单糖组成，结果表明:GLP-1由5种单糖组成，分别是甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖; GLP-2和GLP-3由8种单糖组成，分别是甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 灵芝

1．1．1 灵芝简介

1．1．2 灵芝的形态特征

1．1．3 灵芝药理作用研究进展

1．2 灵芝的培养

1．2．1 栽培技术研究进展

1．2．2 液体发酵技术研究进展

1．3 灵芝多糖的研究进展

1．3．1 灵芝多糖简介

1．3．2 灵芝多糖提取

1．3．3 多糖的分离纯化

1．3．4 多糖纯度检验方法

1．3．5 多糖的结构分析

1．4 灵芝其它化学成分的研究进展

1．4．1 灵芝酸

1．4．2 核苷类

1．4．3 生物碱类和甾醇类化合物

1．4．4 微量元素

1．4．5 氨基酸及多肽类化合物

1．4．6 脂肪酸和挥发油

1．4．7 其他

1．5 抗氧化性研究概况

1．5．1 自由基简介

1．5．2 自由基对机体组织的损伤

1．5．3 自由基的清除

1．5．4 体外抗氧化性评价方法

1．6 本课题研究依据及主要研究内容

1．6．1 立题依据

1．6．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种和子实体

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 三种灵芝子实体的化学成分测定方法

2．2．1 常规营养成分测定方法

2．2．2 微量元素测定方法

2．2．3 氨基酸组成测定方法

2．2．4 脂肪酸组成测定方法

2．2．5 灵芝酸含量测定方法

2．3 多糖和蛋白质含量的测定方法

2．3．1 葡萄糖标准曲线的绘制方法

2．3．2 样品的多糖含量测定方法

2．3．3 粗多糖中的多糖含量测定方法

2．3．4 蛋白质含量的测定方法

2．4 灵芝菌丝体培养及其胞外多糖的制备方法

2．4．1 菌种活化

2．4．2 种子培养

2．4．3 5L发酵罐培养

2．4．4 胞外多糖的制备

2．5 四种粗多糖体外抗氧化活性测定方法

2．5．1 ABTS自由基清除能力测定

2．5．2 DPPH自由基清除能力测定

2．5．3 羟基自由基清除能力测定

2．5．4 还原力测定

2．6 安徽1号样多糖提取工艺优化

2．6．1 多糖提取单因素试验方法

2．6．2 多糖提取晌应面优化试验方法

2．7 安徽1号样粗多糖的制备及分离纯化方法

2．7．1 粗多糖的制备及分离纯化流程

2．7．2 粗多糖的制备

2．7．3 Sevage法脱蛋白

2．7．4 大孔吸附树脂脱色

2．7．5 透析

2．7．6 DEAE-650离子交换柱层析纯化

2．7．7 葡聚糖凝胶柱层析

2．7．8 纯度鉴定方法

2．8 安徽1号样多糖的基本理化性质及结构分析

2．8．1 多糖基本理化性质

2．8．2 紫外光谱分析

2．8．3 红外光谱分析

2．8．4 纯化多糖样品的单糖组成分析

2．9 统计分析

3 结果与讨论

3．1 三种灵芝子实体的化学成分分析

3．1．1 常规营养成分含量

3．1．2 微量元素含量

3．1．3 氨基酸组成

3．1．4 脂肪酸组成

3．1．5 灵芝酸A和灵芝酸B的含量

3．1．6 本节小结

3．2 四种粗多糖的体外抗氧化活性

3．2．1 四种粗多糖的多糖含量

3．2．2 四种粗多糖的蛋白质含量

3．2．3 四种粗多糖的体外抗氧化活性

3．2．4 本节小结

3．3 安徽1号样多糖提取工艺优化

3．3．1 多糖提取单因素实验结果与分析

3．3．2 多糖提取中心组合试验及其结果

3．3．3 模型的建立及其显著性检验

3．3．4 多糖提取响应面结果

3．3．5 多糖提取最佳工艺及其验证试验结果

3．3．6 本节小结

3．4 安徽1号样多糖的分离纯化及结构测定结果

3．4．1 多糖脱蛋白

3．4．2 多糖脱色

3．4．3 DEAE-650离子交换柱层析纯化

3．4．4 葡聚糖凝胶G-100柱层析纯化

3．4．5 多糖纯度鉴定

3．4．6 纯化多糖样品的基本理化性质

3．4．7 紫外光谱扫描

3．4．8 红外光谱扫描

3．4．9 纯化多糖样品的单糖组成分析

3．4．10 本节小结

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢