人工设计并合成酿酒酵母最小线粒体基因组

摘要

线粒体(Mitochondria)是真核生物体内两个含有非细胞核基因组的双层膜细胞器之一，参与了细胞内的能量代谢、中心代谢物的合成、离子平衡及细胞凋亡等生物过程。虽然线粒体基因组在长期的进化过程中大部分的基因已转移到了细胞核中，但依然保留了一些基因。本课题通过分析狭义酵母属（Saccharomyces sensu stricto）的线粒体基因组，以探索线粒体基因组在自然进化中的机理，为人工设计最小线粒体基因组提供理论指导。主要研究内容如下: (1)从酵母Saccharomyces mikatae和Saccharomyces kudriavzevii中利用差速离心的分离得到对应的线粒体，将分离的得到的线粒体通过SDS破碎、酚氯仿抽提及乙醇沉淀得到纯净的线粒体基因组。 (2)将上述分离提取所得到的Saccharomyces mikatae和Saccharomyces kudriavzevii线粒体基因组利用Illumina测序平台建库测序并将得到的测序文库利用SOAPdenovo进行拼接组装得到完整的线粒体基因组序列，其中Saccharomyces mikatae的基因组大小为73KB，Saccharomyces kudriavzevii的基因组大小为72KB。 (3)以酿酒酵母S.cerevisiae的线粒体基因组为参照，对测序得到的Saccharomyces mikatae和Saccharomyces kudriavzevii线粒体基因组进行基因注释，并利用tRNAscan,RNAweasel和MFannot软件确定线粒体基因组中的tRNAs、rRNAs和内含子的具体位置。 (4)以测序和下载得到的一共15个菌株的线粒体基因组为基础用MEGA构建进化树，并进一步分析其的功能基因、基因组结构和内含子位置等基因组特性以揭示其在进化过程中的机理。 (5)通过基因组比较与进化分析推测祖先状态线粒体基因组属性，分析功能区域与非功能区域的保守性，去除线粒体内的基因间非保守区段和内含子区域，设计并合成一个最小线粒体基因组。

目录

声明

摘要

1前言

1．1线粒体概述

1．2线粒体基因组

1．3合成基因组学

1．4酿酒酵母线粒体基因组

1．5立题背景及意义

1．6主要研究内容

1．7技术路线

2材料与方法

2．1．1菌种

2．1．2试剂

2．1．3主要仪器和设备

2．1．4主要培养基

2．1．5主要试剂

2．2实验方法

2．2．1酵母高拷贝线粒体细胞的培养

2．2．2酵母线粒体提取

2．2．3酵母线粒体基因组提取

2．2．4酵母线粒体基因组的测序拼接注释

2．2．5基因的相似性分析及进化树的构建

2．2．6酵母线粒体基因组组成及占比的分析

2．2．7基因间区段和酵母基因组大小相关性分析

2．2．8基因间区段的组成分析

2．2．9 GC簇分析

2．2．10内含子的分析

2．2．12 rho0细胞的制备

2．2．13 Gibson组装

2．2．14 Phusion Polymerase高保真DNA聚合酶PCR体系

3结果与讨论

3．1．1酵母线粒体基因组的提取

3．1．2线粒体基因组的拼接组装及基因注释

3．2．1酵母属相关线粒体基因组的获得

3．2．2线粒体基因的相似性比较

3．2．3进化树的构建

3．3酵母线粒体基因组的分析

3．3．1酵母线粒体基因组的组成及占比

3．3．2基因间区段对酵母线粒体基因组的影响

3．3．3线粒体基因组GC簇的分析

3．3．4 Oris区域中GC簇的分析

3．3．4 cox1、cob和rnl基因的内含子分析

3．4最小线粒体基因组的设计

3．5 rho0细胞的制备和验证

3．6线粒体基因组合成

4结论

4．1本论文的主要结论

4．2本论文创新点

4．3本论文的不足

5展望

参考文献

7攻读学位期间发表论文情况

致谢

附录