酿酒酵母中甘草次酸人工合成体系的构建与优化

摘要

甘草次酸是五环三萜化合物的一种，由于其广谱的药物活性和特殊的中间体结构被广泛地应用于医药、化妆品和食品等领域，具有抗炎、抗病毒、降血脂、防治肿瘤和抗艾滋病等多种作用，也是一种极其重要的解毒剂。甘草次酸目前主要由甘草酸水解产生，生产工艺复杂、周期长、耗能高、污染环境、成本高、产品收率低，不符合绿色发展理念。随着代谢工程与合成生物学的不断发展，人工构建微生物在合成天然产物方面显示出了独特的优势，已成为国际工业生物技术研究的焦点。本研究利用分子生物学技术和代谢工程手段，在酿酒酵母中引入异源甘草次酸合成途径，并对甘草次酸合成途径进行优化，结合优化发酵方式和改变碳源的来源，提高酿酒酵母工程菌中甘草次酸的产量。研究结果如下：
　　通过文献检索和酿酒酵母全基因组序列分析，确定并克隆了用于控制功能基因表达的启动子和终止子；依据酿酒酵母密码子的偏好性，密码子优化后化学合成了来源于光果甘草中的β-香树脂醇合酶bAS、P450单加氧酶CYP88D6和CYP72A154；克隆获得了来源于拟南芥的P450还原酶AtCPR1和AtCPR2。按照启动子—功能基因—终止子模式通过重叠延伸PCR构建了β-香树脂醇合酶、P450单加氧酶和 P450还原酶的基因表达盒，并通过同源重组方式将基因表达盒整合到单倍体酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组上，在酵母中实现了甘草次酸人工合成途径的构建，液相色谱质谱证明在工程菌中成功合成目标产物甘草次酸，产量达到25.5μg/L。
　　分别以单倍体酿酒酵母CEN.PK2-1C、CEN.PK2-1D和二倍体酿酒酵母INVSc1为底盘宿主，研究了甘草次酸合成途径与底盘宿主的适配性关系，发现以单倍体酿酒酵母为底盘宿主更有利于甘草次酸的合成，比以二倍体酿酒酵母INVSc1为底盘宿主时甘草次酸产量提高了100％。
　　以三萜合成途径中的直接前体物2,3-氧化鲨烯为代谢调控节点，过表达酿酒酵母内源基因鲨烯单加氧酶（ERG1）促进鲨烯转化为2,3-氧化鲨稀，过表达鲨烯合酶（ERG9）以提高鲨烯供应，使甘草次酸的产量提高到36.1μg/L。
　　从发酵工程角度考虑，以补料批式发酵方式培养工程酿酒酵母，发酵结果表明，以葡萄糖为碳源补料批式发酵时，甘草次酸产量提高了71.8%，当以乙醇补料批式发酵时，甘草次酸产量达到48.6μg/L，比葡萄糖为碳源补料批式发酵提高了73%，说明乙醇作为碳源更有利于甘草次酸的合成。

目录

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绪论

第1章 文献综述

1.1 甘草次酸概述

1.2 甘草次酸的生物合成

1.3萜类化合物的酵母合成优势

1.4 酿酒酵母中代谢途径的人工组装策略

1.5 酿酒酵母合成萜类的情况及高效调控策略

1.6本课题研究的内容与意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 甘草次酸及其代谢产物的提取与测定

第3章 甘草次酸合成途径在酿酒酵母中的构建

3.1 甘草次酸生物合成途径的设计

3.2 酿酒酵母启动子与终止子的克隆

3.3 基因表达盒的构建

3.4 甘草次酸合成途径在酿酒酵母中的组装

3.5 甘草次酸合成途径在酿酒酵母中的表达验证

3.6 酿酒酵母工程菌C-CPR12发酵产物的鉴定

3.7 小结

第4章 甘草次酸人工合成细胞的优化与发酵

4.1 酿酒酵母细胞底盘的优选

4.2 强化2.3-氧化鲨烯流对甘草次酸合成的影响

4.3 过表达法尼基焦磷酸合酶对甘草次酸合成的影响

4.4 不同工程菌株的发酵效果

4.5 小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 对今后工作的建议与展望

参考文献

致谢

作 者 简 介

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