中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarigans)生物钟和内分泌对低温的应激响应与适应

摘要

冬眠是部分动物保存体能、避开寒冷、饥饿和疾病等不利环境的自我保护方式和在漫长适应进化过程中获得的重要生存策略之一。传统观点认为，两栖类等变温脊椎动物的冬眠是对环境低温和食物匮乏的被动适应，属于简单的冷麻痹现象。然而，我们认为两栖类进入冬眠的过程是一种节律内稳态向另一种节律内稳态的过渡，而生物钟可能在生理和分子水平上参与了整个过程的节律控制。本研究提出并尝试解释的科学问题是:中华大蟾蜍中枢与外周生物钟对冷刺激的敏感性是否存在差异？冬眠中蟾蜍在缺乏授时因子条件下生物钟能否保持运行以及节律振荡特征是否发生了改变？研究结果如下:
　　1、脑组织生物钟基因表达变化
　　在初始状态(22℃)下，脑组织Clock、Bmal1、Per2和Cry2 mRNA的表达均表现出明显的昼夜变化(p＜0.05)，其中Bmal1基因mRNA表达呈现出显著的昼夜节律性(p＜0.05，SE(A)/A＜0.3），峰值处于6:00至18:00之间，之后表达量开始逐渐下降。Clock、Per2和Cry2三者的mRNA表达模式较为相似，峰值都出现在6:00。Per1和Cry1基因表达均没有明显的昼夜变化(p＞0.05)。在低温(4℃，黑暗)24h内，Clock、Bmal1、Per2、Cry1和Cry2的表达发生了明显变化(p＜0.05)，仅Per1对低温未作出响应(p＞0.05)。Bmal1基因mRNA表达持续升高，而Cry2mRNA表达持续下降。Per2的表达呈现出明显的昼夜节律模式(p＜0.05，SE(A)/A＜0.3），其峰值出现在22:00(p＜0.05)。与初始状态相比，Cry2的平均表达量显著降低(p＜0.05)，但其他各钟基因的平均表达量变化不明显(p＞0.05)。经过低温驯化45d后，大多数钟基因没有明显变化，仅Cry1存在显著的变化(p＜0.05)。同时，Per1和Cry1平均表达量较初始状态均显著升高(p＜0.05)，而Per2与之相反。在初始状态下，脑组织Thrβ基因表达量统计上没有显著差异(p＞0.05)，而经过低温(4℃，黑暗)冷暴露24h和低温45d驯化后，Thrβ基因表达量均发生显著变化(p＜0.05)，且Thrβ平均表达量显著低于初始状态(p＜0.05)。
　　2、肝组织生物钟基因表达变化
　　初始状态(22℃)下，肝组织Clock、Bmal1和Cry2基因mRNA表达均发生显著变化(p＜0.05)，其中Bmal1基因mRNA表达呈现出显著的昼夜节律变化模式(p＜0.05，SE(A)/A＜0.3），波峰值和谷值分别出现在10:00和2:00。Clock mRNA表达峰值出现在10:00(p＜0.05)，两者的mRNA水平似乎都表现出白天高晚上低，具有一定的同步性。在低温（4℃，黑暗）冷暴露24h内，肝脏大多数生物钟基因没有作出反应(p＞0.05)，仅Per2 mRNA表达发生显著变化(p＜0.05)。此外，所有生物钟基因mRNA平均水平较初始状态没有明显的变化(p＞0.05)。经过低温驯化45d后，Clock、Bmal1、Per2和Cry1的mRNA表达恢复了明显的变化(p＜0.05)，其中Bmal1和Per2的峰值都出现在2:00，这两者在表达模式上具有一定的同步性。Per1和Cry2 mRNA表达没有发生明显变化(p＞0.05)。Bmal1、Per1、Cry1和Cry2 mRNA平均水平在初始状态下表现出低表达、振幅小，而经过低温驯化后mRNA平均水平呈现出高表达(p＜0.05)、振幅大。在本研究的三种实验处理下，肝组织Thrβ基因mRNA表达统计上均未有显著性差异(p＞0.05)，同时Thrβ基因mRNA整体平均表达水平在它们之间也没有差异性(p＞0.05)。
　　3、内分泌激素水平含量变化
　　在初始状态(22℃)和低温（4℃，黑暗）冷暴露24h内血清CORT含量都没有明显的变化(p＞0.05)，但CORT平均含量受到低温冷暴露的显著抑制(p＜0.05)。经过低温驯化45d后，血清CORT含量存在显著变化(p＜0.05)，其峰值出现在10:00，之后呈逐渐下降趋势，同时CORT平均含量与初始状态没有显著差异(p＞0.05)。在初始状态和低温（4℃，黑暗）冷暴露24h内血清MT含量均有明显的变化(p＜0.05)，其峰值都出现在10:00。经过低温驯化45d后，血清MT含量没有显著变化(p＞0.05)。在初始状态下，血清T3含量发生了显著的昼夜节律变化(p＜0.05，SE(A)/A＜0.3），峰值出现在6:00，之后呈现出逐渐下降趋势。在低温（4℃，黑暗）冷暴露24h内，虽然血清T3含量没有发生明显变化(p＞0.05)，但其平均含量与初始状态有显著变化(p＜0.05)。经过低温驯化45d后，血清T3含量发生了明显的变化(p＜0.05)，且其平均含量与初始状态有显著升高(p＜0.05)。在初始状态和经过低温驯化45d后，血清T4含量发生明显的变化(p＜0.05)，而在低温（4℃，黑暗）冷暴露24h内未发生显著变化(p＞0.05)，且其平均含量较初始状态也未发生明显变化(p＞0.05)。经过低温驯化45d后，血清T4平均含量较初始状态呈现出显著性降低(p＜0.05)。
　　4、器官组织间钟基因的比较
　　初始状态的Clock、Bmal1、Cry2在脑和肝脏内均保持振荡，而Per2基因只在脑内振荡，Per1和Cry1在两种器官内不振荡。脑内大多数钟基因对冷刺激做出了快速响应，振荡明显，但Cry2平均表达量明显下降。相反，除Per2外，肝脏内绝大多数钟基因的振荡不明显。此外，冷应激对脑和肝的Per1基因表达无影响。在低温驯化中脑内大多数钟基因振荡不明显，仅Cry1存在明显的振荡，但Per1和Cry1基因出现了高表达。然而，肝脏内Bmal1、Per2、Cry1存在明显的振荡且振幅明显加大，表达峰值均出现在2:00，而且大多数钟基因(Bmal1、Per1、Cry1、Cry2)出现了高表达。Cry1在两种器官中均表现出明显的振荡，而Bmal1和Per2只在肝脏中明显振荡，但Clock失去了振荡。另外，Per1和Cry1基因在两种器官中出现了高表达，而Bmal1和Cry2仅在肝脏内高表达。
　　由此可见，虽然脑的钟系统对冷刺激的敏感性要明显高于肝脏，但在低温驯化中脑内钟系统基本处于停止或处于无序状态，而肝脏钟系统却表现出强劲而有序的振荡。

目录

摘要

1 综述

1．1 生物钟

1．2 生物钟基因及分子机制

1．3 生物钟与温度

1．4 激素节律信号

1．4．1 糖皮质激素

1．4．2 甲状腺激素

1．4．3 褪黑激素

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 实验设计

2．2 取样

2．3 基因cDNA克隆与分析

2．3．1 设计简并引物

2．3．2 总RNA提取与纯化

2．3．3 合成cDNA第一链

2．3．4 PCR扩增

2．3．5 PCR产物纯化

2．3．6 连接与转化

2．3．7 转化子PCR检测

2．3．8 DNA测序与分析

2．4 实时荧光定量PCR分析

2．5 血清激素分析

2．5．1 皮质酮测定

2．5．2 褪黑激素测定

2．5．3 甲状腺激素T3测定

2．5．4 甲状腺激素T4测定

2．6 数据统计分析

3 结果

3．1 脑组织

3．1．1 脑组织生物钟基因表达变化

3．1．2 脑组织甲状腺受体基因表达变化

3．2 肝组织

3．2．1 肝组织生物钟基因表达变化

3．2．2 肝组织甲状腺受体基因表达变化

3．3 血清皮质酮水平的昼夜变化

3．4 血清褪黑激素水平的昼夜变化

3．5 血清甲状腺激素水平的昼夜变化

4 讨论

4．1 初始状态生物钟基因的表达模式

4．2 生物钟基因对冷应激的响应

4．3 生物钟基因表达对低温驯化的适应

4．4 内分泌激素水平变化分析

参考文献

致谢

攻读硕士学位期何所获得科研成果

攻读硕士学位期间参加的学术会议

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