高产洛伐他汀青霉菌株的筛选与发酵条件优化

摘要

青霉(Penicillium)是中国重要的工业微生物资源。早在1976年，远藤章等在青霉属菌株发酵产物中发现了首个他汀类物质，自此掀起了他汀类物质的研究热潮。其中，洛伐他汀(Lovastatin)是各国公认的降低胆固醇的理想药剂，具有高效、低毒、安全的特点，近年来在临床治疗方面应用十分广泛。
　　本研究从自然生境中分离纯化得到1株高产Lovastatin的青霉菌株Po-25菌株，并对其发酵条件进行了优化。
　　首先，从自然界（食品、土壤、空气、有机质等）中分离得到300余株纯培养，结合菌落自然生长状态和菌落显微特征筛选得到163株青霉属菌株。采用薄层层析色谱(TLC)法对这163株青霉属菌株的发酵液进行初筛，筛选出拟产Lovastatin且含量较高的20株菌株，再通过高效液相色谱(HPLC)法对筛选出的20株菌株的发酵液进行定量分析。结果表明，不同菌株之间Lovastain产量差异较大，其中25号菌株的产量最高，达36.38mg/L。
　　对筛选出的20株菌株进行鉴定，分别扩增了20株菌株的ITS序列，通过序列比对和同源性分析，构建系统发育树，再参照其形态特征进行分类鉴定，最后将这20株菌鉴定为7个种。其中，草酸青霉(Penicillium oxalicum)8株，桔青霉(P.citrinum)3株，疣孢青霉（P verruculosum）2株，产黄青霉（P chrysogenum）2株，扩展青霉（P.expansum）2株，皮落青霉（P crustosum）1株，微紫青霉(P.janthinellum)1株。产量最高的25号菌株经鉴定为草酸青霉(P.oxalicum)，将其标记为Po-25菌株，作为后续实验的出发菌株。
　　之后，用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术对Po-25菌株发酵液中的Lovastatin进行了确证，同时排除了青霉素和桔霉素的存在。此外，通过摇瓶发酵绘制了Po-25菌株的生长曲线及Lovastatin动态变化曲线，发现该菌生长迅速，在10％接种量的情况下，第四天菌丝量即达到最大值，第七天Lovastatin产量达到最大值，适应于快速大量的生产。
　　其次，为了进一步提高Po-25菌株的Lovastatin产量，对其培养基配方和培养条件进行了单因素摇瓶发酵优化，得到Po-25菌株产Lovastatin的适宜条件为:甘油为碳源，蛋白胨为氮源，温度28℃，初始pH5.0，碳源浓度6％，氮源浓度0.8％，接种量7％，摇床转速180rpm。在上述条件下，Po-25菌株发酵产Lovastatin的水平最高。
　　最后，在单因素优化的基础上，运用Plackett-Burman(P-B)试验设计法对影响Po-25菌株液态发酵产Lovastatin的显著因素进行筛选，得到四个显著因素，分别为温度、初始pH、碳源浓度和氮源浓度。再利用响应面Box-Behnken法对这四个显著因素进行优化，得到以下回归方程:Lovastatin=200.48+5.52A-5.30B+10.71C-7.77D+0.61AB+4.37AC-5.68AD-2.60BC+6.31BD-0.99CD-17.11A2-28.22B2-10.84C2-11.08D2。
　　根据数据分析得出的理论最优条件，结合实际操作的现实性，得到Po-25菌株产Lovastatin的最佳条件为:温度28℃，初始pH4.8，碳源浓度6.52‰氮源浓度0.72‰接种量7％，摇床转速180rpm。优化后的Lovastatin产量达到204.306mg/L。

目录

论文说明

摘要

第一章文献综述

1青霉属真菌简介

2青霉属真菌活性代谢产物研究进展

2．1生物碱类

2．2聚酮类

2．3萜类化合物

2．4其他化合物

3新型活性物质生产菌株的来源

3．1海洋

3．2极地

3．3动、植物内生菌

3．4胁迫培养

4青霉属真菌的其他功能与应用

4．1产酶

4．2产色素

4．3环境治理

4．4食品加工

4．5其他

5 Lovastain研究进展

5．1 Lovastatin简介

5．2 Lovastatin的生物合成

5．3 Lovastatin的功能

6立题背景和主要研究内容

第二章高产Lovastatin青霉菌株的收集与筛选

1材料与仪器

1．1菌株来源

1．2培养基

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2实验方法

2．1菌株的分离、纯化

2．2青霉菌株筛选

2．3产Lovastatin菌株初筛

2．4高产Lovastatin菌株复筛

3结果与分析

3．1青霉菌株的分离、纯化

3．2产Lovastatin菌株初筛

3．3高产Lovastatin菌株复筛

4讨论

第三章产Lovastatin青霉菌株的鉴定

1材料

1．1菌株来源

1．2培养基

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2实验方法

2．1菌株形态鉴定

2．2菌株的分子生物学鉴定

3结果与分析

3．3系统发育树

3．4菌株鉴定结果

4讨论

第四章菌株应用可行性分析

1材料

1．1菌株来源

1．2培养基

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2实验方法

2．1 Lovastatin确证

2．2青霉素检测

2．3桔零素检测

2．4生长曲线

2．5 Lovastatin动态变化

3结果与分析

3．1 Lovastatin确证

3．2青霉素检测

3．3桔霉素检测

3．4生长曲线

3．5 Lovastatin动态变化

4讨论

第五章摇瓶发酵工艺的优化

1材料与仪器

1．1菌株来源

1．2培养基

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2实验方法

2．1温度对Lovastatin产量的影响

2．2初始pH对Lovastatin产量的影响

2．3碳源种类的筛选

2．4氮源种类的筛选

2．5碳源浓度对Lovastatin产量的影响

2．6氮源浓度对Lovastatin产量的影响

2．7摇床转速对Lovastatin产量的影响

2．8接种量对Lovastatin产量的影响

3结果与分析

3．1温度对Lovastatin产量的影响

3．2初始pH对Lovastatin产量的影响

3．3碳源种类的筛选

3．4氮源种类的筛选

3．5碳源浓度对Lovastatin产量的影响

3．6氮源浓度对Lovastatin产量的影响

3．7摇床转速对Lovastatin产量的影响

3．8接种量对Lovastatin产量的影响

4讨论

第六章培养基配方及发酵条件的响应面优化

1材料

1．1菌株来源

1．2培养基

1．3主要试剂

1．4主要仪器

2实验方法

2．1种子培养

2．2 P-B设计筛选关键发酵因素

2．3响应面优化

3结果与分析

3．1 P-B设计筛选关键发酵因素

3．2响应面优化

4讨论

第七章小结与建议

1小结

2建议

参考文献

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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