靶向EGFR家族成员分泌PD-1抗体的CAR-T细胞治疗肺癌的实验研究

摘要

肺癌是严重危害人类健康及影响人们生活质量的重大疾病之一，在全世界范围内其发病率和死亡率占人类常见肿瘤的第三位。2015年预计有超过22万新增病例被诊断为肺癌，而且同年死于肺癌的患者将超过15.8万。目前临床上肺癌常见的治疗方法，包括外科手术切除治疗，放射线治疗，化疗等并不能减少肺癌的发生率，肺癌患者的5年生存率并不高，因此迫切需要寻求新的治疗方法。近年来，免疫治疗作为癌症治疗的新方法，引起了研究者极大的兴趣。癌症靶向免疫疗法，例如免疫检查点抑制剂，已经演化成第四种肺癌治疗的策略，给癌症患者带来了新的希望。
　　在肿瘤免疫细胞治疗中，T细胞具有将肿瘤抗原作为外来物识别的能力并且能够快速清除它们，尽管存在细胞毒性T细胞识别肿瘤相关抗原，肿瘤细胞也常常逃脱或逃避免疫系统的攻击。机体产生的免疫反应与一系列共刺激分子及共抑制分子紧密相关，免疫检查点是肿瘤细胞逃脱或逃避免疫系统攻击的一种主要方式。目前已经发现的抑制性免疫检查点有细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)以及PD-1的两个主要配体PD-L1和PD-L2等，它们能够导致效应T淋巴细胞的耗竭和减少，减弱机体免疫系统产生的抗肿瘤反应。
　　随着人们对免疫检查点和抗肿瘤免疫反应理解及认识的加深，生产免疫检查点阻断单抗是修复免疫系统和恢复T细胞抗肿瘤免疫反应的有效方式。临床实验发现靶向程序性细胞死亡蛋白1或其配体PD-L1的单抗对大多数肿瘤都有临床反应，包括恶性黑色素瘤、肺癌、卵巢癌等。尽管抗PD-1抗体阻断治疗对恶性黑色素瘤或非小细胞肺癌患者有很好的疗效，但是其较高的生产成本和药物不良反应限制了它在临床中的运用。本文构建并检测了靶向EGFR家族成员并且高水平稳定表达PD-1抗体的HerinCAR-T细胞对几种肺癌细胞株的体外及体内杀伤作用。
　　(1)构建包含PD-1单链抗体可变区的重组质粒，通过piggyBac转座子系统转染T细胞，获得能够高水平稳定表达PD-1抗体(5-10ug/ml)的T细胞(PIK-PD1)，同时Western blotting实验证明T细胞分泌的PD-1抗体包含正确的重链(50Kd)。
　　(2)检测PIK-PD1细胞分泌的PD-1抗体的功能，包括封闭活化T细胞表面表达的共抑制分子PD-1、Tim3以及LAG3，促进T细胞的增殖。通过流式检测发现表达PD-1抗体的PIK-PD1细胞相比未电转的对照T细胞而言能够增强CD107α，记忆标志CD62L、CD45RO、CCR7的表达。
　　(3)构建表达PD-1抗体的HerinCAR-T细胞（PD1-HerinCAR-T），通过检测其与肿瘤细胞共培养后细胞因子的分泌，发现IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌量相比对照的HerinCAR-T细胞而言明显要高。同时发现PD1-HerinCAR-T细胞能够更有效的杀伤肺癌细胞株NCI-H1299，NCI-H460,NCI-H23和H446。
　　(4)NCI-H460小鼠移植瘤模型中，分泌PD-1抗体的CAR-T细胞治疗组相比PBS和Control T细胞治疗组能够更有效地抑制肿瘤的生长，且PD1-HerinCAR-T细胞在小鼠体内能更好地增殖。
　　本文首先构建了能够高水平稳定表达PD-1抗体的T细胞，并且发现T细胞分泌的PD-1抗体能够促进T细胞的增殖，细胞因子的分泌，封闭活化T细胞表面PD-1、LAG3、Tim3等抑制性免疫检查点的表达。同时也构建了表达PD-1抗体的HerinCAR-T细胞，发现PD1-HerinCAR-T细胞在体外和体内实验中能够更有效的杀伤肺癌细胞株。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 免疫检查点PD-1的概念及研究进展

1．1 程序性细胞死亡蛋白1的概念及介绍

1．2 PD-1负调控T细胞活性的机制

1．3 阻断PD-1信号通路的研究进展

1．4 本课题研究的内容及创新点

1．4．1 研究内容

1．4．2 创新点

第二章 构建高水平稳定表达PD-1抗体的T细胞

2．1 实验材料及试制、仪器设备

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．1．4 实验所需引物

2．1．5 主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 pNBS328-anti-PD-1质粒的构建

2．2．2 电转获得稳定表达PD-1抗体的T细胞

2．2．3 PIK-PD1T细胞中PD-1抗体表达量的检测

2．3 实验结果

2．3．1 pNBS328-anti-PD1结构示意图及质粒构建结果

2．3．2 T细胞分泌的PD-1抗体的浓度

2．3．3 PIK-PD1 T细胞分泌的PD-1抗体重链的鉴定

2．3．4 RT-PCR检测PD-1抗体的相对表达水平

2．4 结果分析和讨论

第三章 阻断PD-1信号通路提高T细胞的活性和功能

3．1 实验器材

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 流式检测PIK-PD1 T细胞表面的免疫检查点

3．2．2 CCK8检测PIK-PD1 T细胞的增殖

3．2．3 流式检测PIK-PD1 T细胞的活化，衰老和记忆标记

3．2．4 流式检测PIK-PD1T细胞、Mock T细胞CD3+CD8+T细胞的百分比

3．3 实验结果

3．3．1 PD-1抗体封闭活化T细胞表面的免疫检查点

3．3．2 PD-1抗体促进T细胞的增殖

3．3．3 流式检测PIK-PD1 T细胞的表型

3．3．4 PIK-PD1细胞中CD3+CD8+细胞的百分比

3．4 结果分析与讨论

第四章 构建表达PD-1抗体的HerinCAR-T细胞

4．1 实验器材

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．1．3 实验试剂

4．2 实验方法

4．2．1 pNBS328-PD1-HerinCAR质粒的构建

4．2．2 电转获得表达PD-1抗体的HerinCAR-T细胞

4．2．3 PD1-HerinCAR-T细胞中PD-1抗体表达量的检测

4．3 实验结果

4．3．1 pNBS328-PD1-HerinCAR结构示意图及质粒构建结果

4．3．2 PD1-HerinCAR-T细胞中PD-1抗体和CAR表达量的检测

4．3．3 RT-PCR检测PD-1抗体和HerinCAR基因在PD1-HerinCAR-T细胞中的表达水平

4．4 结果分析和讨论

第五章 PD1-HerincCAR-T细胞的功能分析

5．1 实验器材

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验仪器

5．1．3 实验试剂

5．1．4 主要试剂的配制

5．2 实验方法

5．2．1 流式检测肺癌细胞受IFN-γ刺激后PD-L1的表达

5．2．2 流式检测各种肿瘤细胞HER2和EGFR抗原的表达

5．2．3 检测PD1-HerinCAR-T细胞对肺癌细胞的体外杀伤能力

5．2．4 流式检测PD1-HerinCAR-T细胞与H460共培养后细胞因子的分泌情况

5．2．5 检测PD1-HerinCAR-T细胞表面的免疫检查点

5．2．6 PD1-HerinCAR-T治疗H460小鼠移植瘤模型的体内实验

5．3 实验结果

5．3．1 IFN-γ刺激后肿瘤细胞表面PD-L1的表达

5．3．2 各肿瘤细胞株HER2和EGFR抗原的流式检测结果

5．3．3 实时监测系统检测PD1-HerinCAR-T细胞对肿瘤细胞株的杀伤作用

5．3．4 PD1-HerinCAR-T细胞与NCI-H460共培养后细胞因子的分泌量

5．3．5 PD1-HerinCAR-T细胞表面的免疫检查点

5．3．6 PD1-HerinCAR-T抑制NCI-H460小鼠移植瘤的生长

5．4 结果分析和讨论

讨论

参考文献

致谢