AML等肿瘤频发的IDH2突变体的结构、功能与稳定性研究

摘要

异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中发挥关键作用的酶家族。人类基因组有5种IDH基因，可编码生成三种异柠檬酸脱氢酶(IDH1、IDH2及IDH3)，其中IDH2位于线粒体，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG)和NADPH。已有研究表明在不同肿瘤中存在各种IDH突变体，包括急性髓细胞白血病(AML)、脑肿瘤、神经胶质瘤等，其最为常见的突变碱基位于R132(IDH1)、R140与R172(IDH2)。IDH突变体将α-KG转化生成肿瘤代谢物2-羟戊二酸(2-HG)，从而紊乱了一系列α-KG依赖性双加氧酶反应。具体表现为:促进组蛋白赖氨酸甲基化;抑制10-11易位酶家族(TET)羟甲基化，进而激活CpG岛的DNA甲基化;稳定缺氧诱导因子(HIF-1α)的表达，上调血管内皮生长因子(VEGF)。
　　本研究通过分析不同突变体的IDH2结构、功能与稳定性，将对深入理解IDH2突变导致肿瘤发生、增殖的分子机制及其诊疗提供一些线索和参考。本研究选用哺乳细胞表达载体pCMV6-AC-Myc-His，通过基因克隆、重叠PCR、双酶切鉴定与测序成功构建11个IDH2重组表达载体:WT、R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P。在此基础上，在293T与小鼠小胶质细胞BV2中瞬时转染过表达IDH2野生型与不同突变体，检测蛋白表达与相关信号通路(Western)、细胞代谢（检测酶活力、葡萄糖及乳酸、ROS变化）、蛋白降解(Western)、蛋白质与热激蛋白90相互作用（免疫共沉淀）等实验，通过生物信息学同源模型构建，分析突变对IDH2结构的影响，并与药物导致蛋白降解的结果进行相互验证与比对，探究IDH2野生型和突变体之间结构、功能与稳定性的差异。结果表明：野生型与突变体R140/R172在293T和BV2细胞中表达水平具有明显差异；突变体IDH2酶活力显著低于野生型；在293T细胞中，与野生型IDH2相比较，R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突变体过表达降低细胞乳酸含量，R172S、R172K、R172W、R172G突变体过表达导致葡萄糖含量升高，R140G、 R140Q、 R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C突变体ROS含量均显著降低;不同突变体的过表达对细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路影响不同，其中多个突变体过表达抑制pAKT和pS6的表达，并导致Cyclin D1表达下调;这些结果表明突变体IDH2过表达减缓了细胞代谢与生长。而在BV2细胞中，过表达R140Q、R140W、R172S、R172K、R172M、R172W、R172G、R172C、R172P突变体增加了TNF-α表达;其中R172S、R172M、R172W、R172G突变体过表达诱导IL-6表达，推测这些突变体的过表达可能与炎症反应的发生有一定的关联；泛素化蛋白连接酶抑制剂Bortezomib对野生型IDH2表达无影响，而对突变体R140G、R140Q、R140W、R172S、R172K表达敏感，促使其蛋白降解;对过表达的突变体R172M、R172W、R172G、R172C、R172P具有耐药性，药物处理过后的表达水平并没有发生明显变化。同源模建结构分析表明相应的点突变影响了蛋白质的结构。HSP90抑制剂17-AAG对突变体IDH2过表达并无影响，免疫共沉淀结果表明HSP90与IDH2无相互作用。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语

第一章 绪论

1 引言

1．1 异柠檬酸脱氢酶的概述

1．2 IDH2突变的发现

1．3 IDH突变的生物学功能

1．4 抑制剂Bortezomib与17-AAG

2 前期研究结果

3 实验目的与意义

4 实验内容及设计方案

4．1 本课题研究内容

4．2 技术路线

第二章 IDH2真核表达载体的构建

1 实验材料、试剂与仪器

1．1 材料与试剂

1．2 主要试剂配制

1．3 主要仪器

2 实验方法

2．1 引物设计及合成

2．2 pCMV6-IDH2-WT重组载体的构建

2．3 pCMV6-IDH2-R140／R172重组载体的构建

3 结果与分析

3．1 pCMV6-IDH2-WT重组载体的构建

3．2 pCMV6-IDH2-R140／R172重组载体的构建

3．3 重组载体pCMV6-IDH2-WT／R140／R172的序列测定

4 讨论

第三章 细胞过表达野生型与突变体IDH2

1 实验材料、试剂与仪器

1．1 材料与试剂

1．2 主要溶液的配制

1．3 主要仪器

2 实验方法

2．1 细胞复苏与传代

2．2 细胞分盘

2．3 细胞转染实验

2．5 蛋白浓度测定

2．6 蛋白质印迹法检测蛋白表达与激活

3 结果与分析

3．1 细胞中过表达野生型与突变体IDH2

4 讨论

第四章 过表达IDH2对293T细胞代谢的影响

1 实验材料与试剂

1．1 材料与试剂

1．2 主要溶液的配制

2．1 酶活力的测定

2．2 乳酸测定

2．3 葡萄糖测定

2．4 活性氧测定

3 结果与分析

3．1 酶活力测定

3．2 乳酸含量测定

3．3 葡萄糖含量测定

3．4 ROS含量测定

4 讨论

第五章 野生型和突变体IDH2过表达对细胞信号通路的影响

1 实验材料与试剂

1．1 材料与试剂

1．2 主要溶液的配制

2 实验方法

3 结果与分析

3．1 过表达IDH2对细胞信号通路的影响

4 讨论

第六章 过表达的IDH2在293T中的稳定性及结构预测分析

1 实验材料与试剂

1．1 材料与试剂

1．2 主要溶液的配制

2 实验方法

2．1 药物抑制实验

2．2 Co-IP实验

3 结果与分析

3．1 Bortezomib对IDH2稳定性的影响

3．2 17-AAG对IDH2稳定性的影响

3．3 IDH2结构稳定性分析

4 讨论

结论

参考文献

硕士期间发表论文

硕士期间获奖情况

致谢