产气肠杆菌(E.aerogenes)ComplexⅠ与氢代谢关系的研究

摘要

能源是人类社会生存和发展的基本条件，针对传统化石能源面临的严峻挑战，寻求新的可再生的替代能源是当今能源发展的趋势，而氢作为优良的能源载体得到了广泛的关注。产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)是一种极具应用前景的兼性厌氧产氢菌，它能广泛地利用各种碳源生长，产氢速率较高，具有工业应用的潜力。
　　本研究通过敲除NADH脱氢酶亲水性亚基的基因(nuoCDE)，过表达小RNA RyhB和NAD合成酶三种方法增强产气肠杆菌产氢速率，并利用高压液相色谱(HPLC)和高效气相色谱分析突变株代谢流的再分配。本文运用CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除产气肠杆菌IAM1183中的nuoCDE基因，得到了一株双敲除突变株IAM1183-CD(△nuoC/△nuoD)和一株三敲除突变株IAM1183-CDE(△nuoC/△nuo D/△nuoE)。100ml血清瓶厌氧发酵实验结果显示突变株IAM1183-CD，IAM1183-CDE的产氢量相较于原始菌分别增加了24.5％，45.6％。其中菌株IAM1183-CDE的NADH产氢途径的产氢量显著增加表明nuoE基因在调节胞内NADH浓度的功能上可能起到了重要的作用。菌株IAM1183/N(nadE)，IAM1183-CD/N(△nuoC/△nuoD/nadE)和IAM1183-CDE/N(△nuoC/△nuoD/△nuoE/nadE)的产氢量分别是IAM1183的1.06，1.35和1.55倍。特别是IAM1183-CDE/N菌株消耗每摩尔葡萄糖可产生2.28摩尔氢气，产氢量得到大幅的提升。菌株IAN1183/R(RyhB),IAM1183-CD/R(△nuoC/△nuoD/RyhB)和IAM1183-CDE/R△nuoC/△nuoD/△nuoE/RyhB）在血清瓶发酵中的产氢水平发生了很大的变化，特别是对NADH产氢途径具有很大的影响。利用菌株IAM1183-CDE/N在5升发酵罐中测定氢气的产量达到6.06升，是原始菌株的1.95倍。三种手段相结合的基因工程方法对发酵制氢工业提供了一种更加经济，更加高效的生物方法。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 引言

1 氢能源前景概述

1．1 传统化石能源面临的问题

1．2 生物炼制的重要性

1．3 生物法制氢的生产方法

2 发酵生物制氢的研究进展

2．1 发酵制氢菌株及其底物利用能力

2．2 发酵制氢代谢途径

2．3 微生物存在的氢酶

3 小RNA RyhB的结构与功能

3．1 小RNA RyhB的结构

3．2 小RNA RyhB的功能

4 本论文的研究对象产气肠杆菌

5 本课题的研究意义和技术路线

5．1 研究意义与立题思想

5．2 研究技术路线

5．3 研究内容

第二章 材料与方法

1 材料

1．1 菌株和质粒

1．2 引物

1．3 基因操作实验相关的酶以及试剂盒列表

1．4 培养基、培养条件及常用试剂的配置

2．2 基因组DNA的小量提取

2．3 琼脂糖凝胶中DNA回收(PCR产物DNA回收)

2．4 基因克隆

2．5 DNA片段的酶切与连接

2．6 DNA片段overlap PCR连接

2．7 多片段连接及其环化

2．8 转化

2．9 琼脂糖凝胶电泳分析

2．10 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2．11 RNA提取及Northern Bolt

2．12 发酵液中葡萄糖含量的测定

2．13 氢酶酶活的检测方法

2．14 基于CRISPER-CAS9基因整合技术

第三章 敲除菌株及质粒的构建

1．2 敲除菌株和引物

1．3 敲除结果

2 构建外源表达小RNA RyhB表达载体

2．1 引言

2．2 菌株和质粒

2．3 Northern Bolt验证

3 构建外源表达Nad合成酶表达载体

3．1 引言

3．2 Nad合成酶表达载体的构建

3．3 SDS-PAGE验证

4 小结与讨论

第四章 基因工程菌株功能检测及发酵产氢结果

1 各菌株生长曲线和pH

2 各菌株血清瓶批式发酵产氢量及代谢产物含量

2．1 测定发酵液中有机酸和醇类的含量

2．2 发酵液中葡萄糖含量的测定

2．3 结果与分析

3 各菌株产氢代谢途径和氢酶酶活分析

3．1 各菌株甲酸途径与NADH产氢途径分析

3．2 各菌株NADH依赖型氢酶酶活分析

4 发酵罐发酵制氢

5 小结与讨论

第五章 总结

参考文献

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢