Saccharomyces cerevisiae OYE2分子改造及其在不对称合成(R)-香茅醛中的应用

摘要

(R）-香茅醛可作为治疗乳腺癌的药物，也是用于L-薄荷醇合成的重要手性间体。(R）-香茅醛的合成包括化学法和生物酶法。生物酶法不对称氢化柠檬醛合成(R）-香茅醛的关键酶是烯醇还原酶，该酶催化顺反异构体混合物的加氢，其产物的手性往往是互补的，因此产物e.e.值往往很低。为了提高烯醇还原酶在不对称氢化反应中的产物e.e.值，本文基于源自Saccharomyces cerevisiae的烯醇还原酶OYE2作了如下工作:(1)OYE2催化的不对称氢化偶联氨基酸催化的异构化反应的体系构建与优化;(2)基于理性设计改造OYE2从而改善其立体选择性;(3)利用荧光法筛选烯醇还原酶的初步探索。
　　为了考察底物与产物转化的对应关系，OYE2分别以(E)-、(Z)-或(E/Z)-柠檬醛柠檬醛为底物进行不对称氢化反应。经11h反应后，(Z)-柠檬醛中16.97％转化为(R）-香茅醛，83.03％转化为（S)-香茅醛;(E)-柠檬醛中94.85％转化为(R）-香茅醛，5.15％转化为（S)-香茅醛。在反应体系构建中，通过添加甲酸脱氢酶及甲酸钠实现辅酶循环，并通过不对称氢化偶联氨基酸催化的异构化反应提高产物e.e.值。优化后的最优体系包括:最适氨基酸为甘氨酸，浓度为1M，pH为7.0。添加1M甘氨酸后，（E/Z）-柠檬醛反应产物的得率和e.e.值分别为91.84％和75.06％，比对照组（不添加甘氨酸）分别提高了23.90％和27.62％。
　　通过对烯醇还原酶OYE2的理性设计提高其立体选择性。经同源建模、分子对接及结构分析，推测底物结合口袋附近的氨基酸残基(如Met39，Pro75，Trp116，Thr196和Phe296)在底物识别中起重要作用。从构建的突变子库中筛选获得了立体选择性提高了的突变子P75M。将其与顺、反柠檬醛分别进行不对称氢化反应，经11h反应后，(Z)-柠檬醛转化为(R）-香茅醛的比例较OYE2提高了23.11％;以(E/Z)-柠檬醛为底物时，(R）-香茅醛e.e.值较OYE2提高了19.38％。添加1M甘氨酸后，反应的(R）-香茅醛的e.e.值比OYE2偶联甘氨酸反应所得值提高了12.66％。结构分析表明P75M的突变使(Z)-柠檬醛α，β-不饱和键的π系统的相对面更容易获取氢，从而有利于(R）-香茅醛的形成。
　　此外，初步建立了利用荧光法筛选烯醇还原酶的流程。在该筛选流程中，异烟肼(INH)在甲醇的铝盐溶液中与柠檬醛的α，β-不饱和键反应形成络合物而产生荧光。该物质在激发波长Ex=400nm及发射波长Em=510nm下荧光信号最强，而且荧光信号的强度跟柠檬醛含量相关。此外，香茅醛在上述条件下不产生荧光。因此，烯醇还原酶催化的反应液与异烟肼反应后，其荧光信号的变化可反映底物量的消耗，从而表征反应体系中烯醇还原酶催化活力的大小。经气相色谱法验证，荧光信号与烯醇还原酶催化活力高度关联。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1．1 手性化合物

1．1．2 香茅醛的简介

1．2 柠檬醛

1．2．1 柠檬醛的简介

1．2．2 柠檬醛的立体选择性

1．2．3 氨基酸催化的柠檬醛顺反异构化反应

1．3 (R)-香茅醛的合成

1．3．2 (R)-香茅醛的生物合成

1．4 烯醇还原酶

1．4．1 烯醇还原酶的来源及功能

1．4．2 烯醇还原酶催化机理

1．5 烯醇还原酶的蛋白质工程改造

1．5．1 烯醇还原酶S．pastorianus OYE1的改造

1．5．2 烯醇还原酶B．subtilis YqjM的改造

1．6 本论文研究背景、内容及意义

第二章 S．cerevisiae OYE2不对称合成(R)-香茅醛

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 重组菌株

2．2．2 试剂

2．2．3 培养基

2．2．4 缓冲液

2．2．5 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 菌种培养

2．3．2 S．Cerevisiae OYE2和C．boidinii FDHCB表达和纯化

2．3．3 (Z)-柠檬醛和(E)-柠檬醛的制备

2．4 异构化反应偶联不对称氢化反应的反应体系优化

2．5 色谱检测条件及各个物质标准曲线的准备

2．6 结果与讨论

2．6．1 烯醇还原酶OYE2和甲酸脱氢酶FDHCB表达和分离纯化

2．6．2 橙花醛和香叶醛的化学合成

2．6．3 各物质的气相色谱图及标准曲线绘制

2．6．3 氨基酸种类对(E／Z)-柠檬醛不对称氢化产物e．e．值的影响

2．6．4 甘氨酸浓度对(E／Z)-柠檬醛不对称氢化产物e．e．值的影响

2．6．5 反应pH值对(E／Z)-柠檬醛不对称氢化产物e．e．值的影响

2．6．6 不对称氢化反应偶联底物异构化反应的反应进程

2．6．7 底物与产物在OYE2催化过程中的对应关系

2．7 本章讨论与小结

第三章 S．cerevisiae OYE2的分子改造及其突变子的合成应用

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌种

3．2．2 试剂

3．2．3 培养基

3．2．4 缓冲液

3．2．5 主要仪器、设备及相关分析软件

3．3 实验方法

3．3．1 同源建模及分子对接

3．3．2 菌种培养

3．3．3 E．coli BL21／pEASY-E1-oye2重组质粒的提取

3．3．4 突变库的构建

3．3．5 大肠杆菌E．coli BL21(DE3)感受态的制备及转化

3．3．6 突变体阳性克隆子的初步鉴定及序列测序

3．3．7 OYE2突变子的分析

3．4 结果与分析

3．4．1 同源建模及分子对接

3．4．2 菌种的培养及质粒的提取

3．4．3 突变子库的构建

3．4．4 突变子的诱导表达及纯化

3．4．5 OYE突变子不对称还原柠檬醛得率及立体选择性的对比

3．4．5 底物与产物在P75M催化过程中的对应关系

3．4．6 P75M与OYE2催化柠檬醛的效果比较

3．4．7 P75M和OYE2分别与(Z)-柠檬醛分子对接的效果比较

3．5 本章讨论与小结

第四章 突变文库筛选方法的探索

4．2．1 菌种

4．2．2 试剂

4．2．3 培养基

4．2．4 主要仪器、设备及相关分析软件

4．3 实验方法

4．3．1 菌种培养

4．3．2 重组蛋白诱导表达纯化

4．3．3 柠檬醛荧光反应及标准曲线的绘制

4．3．3 荧光鉴定法用于突变文库的筛选效果

4．4 结果与分析

4．4．1 柠檬醛产生荧光情况

4．4．2 荧光鉴定法用于突变文库的筛选效果

4．5 本章讨论与小结

第五章 总结与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况