采用PCR-DGGE方法研究浙江玫瑰醋酿造过程中的微生物多样性

摘要

浙江玫瑰醋是一种复杂微生物参与的传统发酵食品。利用PCR-DGGE技术研究传统发酵食品中的微生物多样性，不仅能够获得群落中优势种类信息，而且能够同时分析多个样品，从而获得发酵过程中复杂的微生物群落演变规律。本文通过提取玫瑰醋样品中的基因组DNA作为模板，对细菌的16S rDNA V3区和真菌18S rDN进行扩增，再将PCR产物用变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分析，通过对DGGE图谱的统计分析和16S rDNA序列分析研究浙江玫瑰醋中微生物群落结构的组成和演变规律。 对玫瑰醋样品中基因组DNA的提取方法进行了探索，通过比较发现传统的CTAB法比试剂盒法更适合食醋中基因组DNA的提取，容易得到高浓度的DNA，较真实的反映了浙江玫瑰醋中的微生物群落结构和组成。对PCR扩增的引物和反应程序进行优化，结果表明：(1)带有“GC发夹”结构的PCR产物在DGGE分析时能得到较好的分离效果，而不带有“GC发夹”的PCR产物在DGGE胶中由于具有相似的电泳行为不能被分离；(2)降落PCR与普通PCR相比，前者的PCR产物在数量和特异性方面都较后者好。 利用DGGE垂直胶确定了细菌和真菌DGGE水平电泳的最佳变性梯度，分别为35％～55％和30％～50％。利用时间进程法确定了DGGE水平电泳的最佳电泳时间为4h。 对不同发酵时间的浙江玫瑰醋样品中的基因组DNA进行PCR扩增，获得的PCR产物进行DGGE电泳分析，细菌和真菌在DGGE中的分散度都非常好，细菌DGGE指纹图谱中有10个明显的主要条带，真菌DGGE指纹图谱中有7个较明显的主要条带。 将从玫瑰醋中分离纯化得到的细菌与不同发酵阶段混合菌群的DGGE指纹图谱进行条带匹配分析，发现条带A与细菌An的条带发生匹配，在DGGE胶中具有相同的电泳行为，经16S rDNA序列分析鉴定为巴氏醋杆菌。对DGGE胶中的其它8个条带进行回收，并通过序列分析建立文库。再将获得的16S rDNA序列登陆NCBI与已知序列进行比对，得到6个发酵过程中的优势细菌，其中醋酸菌2种，分别是巴氏醋杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌；乳酸菌5种，分别是肠膜明串珠菌肠膜亚种、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌。真菌条带的DNA序列由于存在特殊结构无法进行分析，尚在鉴定中。 将16SrDNA的序列分析结果与DGGE指纹图谱相结合，进一步阐明了浙江玫瑰醋整个发酵阶段的微生物群落演变规律。整个发酵过程微生物群落结构由复杂变为简单，并且发花阶段和发酵阶段的微生物群落结构有较明显的筹异。发花阶段鉴定到的细菌有肠膜明串珠菌肠膜亚种、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌4种；发酵阶段鉴定到的细菌有巴氏醋杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌。肠膜明串珠菌肠膜亚种只在发酵第9天和第11天的样品中检测到。罗伊氏乳杆菌在发酵第13天至49天的样品中检测到，且条带的亮度随发酵的进行逐渐减弱。干酪乳杆菌只在发酵第13天的样品中被检测到。嗜酸乳杆菌在发酵第18天至33天的样品中检测到较亮的条带，随后条带的亮度减弱甚至消失。氧化葡萄糖酸杆菌在发酵第129天后的样品中均检测到较亮的条带，说明此菌种在发酵129天后才迅速生长繁殖成为优势菌种。巴氏醋杆菌在发花阶段快结束时才开始生长繁殖。罗伊氏乳杆菌对应的条带在第49天后的样品中均未检测到。而保加利亚乳杆菌和巴氏醋杆菌在所有样品中均检测到较亮的条带，即在整个发酵过程中始终保持优势地位。浙江玫瑰醋发酵成熟时细菌群落组成为保加利亚乳杆菌、巴氏醋杆菌和葡萄糖酸杆菌。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1浙江玫瑰醋的概述

1.1.1食醋的概述

1.1.2浙江玫瑰醋的简介及工艺特色

1.1.3浙江玫瑰醋的现状

1.2传统发酵食品的微生物多样性研究进展

1.2.1传统发酵食品的特点

1.2.2传统发酵食品的微生物多样性概述

1.2.3分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用

1.3变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术

1.3.1 PCR-DGGE技术基本原理

1.3.2 PCR-DGGE技术的应用工作流程

1.3.3 PCR-DGGE技术在微生物多样性研究中的应用

1.3.4 PCR-DGGE技术的优缺点

1.4本文研究目的和内容

1.4.1研究目的

1.4.2研究内容

第二章基因组总DNA抽提及PCR扩增

2.1实验部分

2.1.1药品及试剂

2.1.2实验方法

2.2结果与讨论

2.2.1浙江玫瑰醋的总酸变化趋势

2.2.2基因组DNA的提取

2.2.3 PCR反应程序的探索与优化

2.3本章小结

第三章浙江玫瑰醋的DGGE分析及微生物多样性评价

3.1实验部分

3.1.1药品及试剂

3.1.2实验方法

3.2结果与分析

3.2.1“GC发夹”结构对DGGE分离效果的影响

3.2.2最佳变性剂浓度梯度的确定

3.2.3最佳电泳时间的确定

3.2.4分离纯化菌株的DGGE水平电泳分析

3.2.5整个发酵阶段微生物群落的DGGE指纹图谱分析

3.2.6细菌DGGE图谱的统计学分析

3.2.7真菌DGGE图谱的统计学分析

3.2.8 16S rDNA文库构建及同源性分析

3.2.9浙江玫瑰醋微生物多样性分析及其产品特质

3.3本章小结

第四章结论及展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

已发表论文及获奖论文

致谢