盐胁迫对飞廉悬浮细胞生长和黄酮类物质合成的影响及其机理研究

摘要

植物细胞中活性成分含量低一直是制约其产业化生产的一大重要因素,要实现植物细胞培养大规模生产药用活性物质,首要条件是提高植物细胞中次级代谢产物的含量。研究表明植物的次级代谢易受环境的影响,逆境因子可以促进细胞次级代谢产物的合成。盐胁迫是植物最常遇到的逆境胁迫因子之一。为了考查盐胁迫对植物细胞次级代谢产物的影响,我们以飞廉悬浮细胞为材料,研究了盐胁迫对飞廉悬浮细胞生长和黄酮类物质代谢合成的影响,并对其相关机理进行了初步研究。主要实验结果如下:
　　 1.优化了飞廉悬浮细胞中的总黄酮物质的提取条件
　　 本论文研究的目标产物为黄酮类代谢产物,其提取效果的好坏直接影响实验的结果,所以我们对其提取条件进行了优化,结果如下:影响悬浮培养飞廉细胞中总黄酮提取的因素主次顺序为:乙醇浓度(A)＞料液比(B)＞提取温度(C)＞提取时间(D),各因素的最佳水平组合为A2B3C1D2,即乙醇浓度为60％,料液比1:20,提取温度为60℃,提取时间为30min。
　　 2.建立了稳定的飞廉悬浮细胞系
　　 为了获得生长速度快,代谢产物含量高的飞廉悬浮细胞系,我们研究了不同激素浓度配比、蔗糖浓度、摇床转速和接种量等因素对细胞生长和代谢的影响。以总黄酮产量为考察指标,确定最佳培养条件为:MS+1×10-5mol/L NAA+2×10-6 mol/L BA+3％蔗糖,pH为5.8,培养温度25℃,摇床转速110 rpm,接种量为3 g/50mL medium。在此培养条件下建立的细胞系生长周期短(约为12天),且飞廉细胞色泽均一、颗粒细小、分散性好。
　　 3.盐胁迫处理可以诱导飞廉悬浮细胞死亡和促进黄酮类物质的代谢合成
　　 盐胁迫处理飞廉悬浮细胞后,荧光显微镜下观察到细胞核被Sytox染成绿色,核物质出现凝集皱缩,凝胶电泳观察到部分核酸发生降解,产生明显的拖尾现象,这些现象非常类似植物细胞的PCD特征。同时盐处理后,细胞内黄酮含量显著提高。为了得到盐胁迫对黄酮类物质的最佳诱导效果,我们分别对不同盐处理浓度和不同盐处理时间进行了研究,发现在细胞继代后第6天,用终浓度为40mmol/L的NaCl溶液对飞廉细胞进行处理,黄酮类物质的总产量是最高的。在该条件处理下,细胞干重为对照的0.83倍,而单位质量细胞内黄酮类物质含量为对照的2.015倍,黄酮类物质产量为对照的1.70倍。
　　 4.NO是介导盐胁迫诱导飞廉细胞死亡和促进黄酮类物质合成积累的必需信号分子
　　 盐胁迫处理后,NO含量在短时间内大幅度提高,引入NO专一性清除剂cPTIO,发现cPTIO将NO清除后可以显著抑制细胞的死亡率,同时黄酮类物质的合成也受到很大的抑制,说明盐胁迫必须依赖NO信号分子来诱导细胞的死亡和促进黄酮类物质的合成,即NO是盐胁迫诱导飞廉细胞死亡和促进黄酮类物质代谢合成的必需信号分子。
　　 5.BI-1基因的诱导表达可以明显抑制盐胁迫诱导的飞廉细胞死亡,但基本不影响盐胁迫对黄酮类物质合成的促进作用
　　 利用农杆菌介导法构建诱导型转BI-1飞廉悬浮细胞,通过加入Est诱导BI-1基因表达,发现BI-1蛋白可以显著抑制盐胁迫引发的细胞死亡,但基本不影响盐胁迫对黄酮类物质合成的促进作用。BI-1+盐处理组的细胞干重为对照的0.91倍,黄酮产量为对照的1.86倍,相比单独盐处理组,黄酮总产量显著提高。从上述实验结果可以推测介导盐胁迫引发飞廉细胞死亡和促进黄酮类物质合成的信号途径是不一样的。BI-1蛋白对盐处理细胞中的NO含量没有影响,说明BI-1蛋白对细胞死亡的抑制作用不依赖NO信号分子。
　　 综述所述,NO信号分子可以介导盐胁迫诱导飞廉细胞的死亡和促进黄酮类物质的合成,BI-1蛋白可以不依赖NO信号分子抑制盐胁迫引发的细胞死亡,但不影响盐胁迫对黄酮类物质合成的促进作用,这暗示盐胁迫可以通过共享NO等信号分子在信号转导的上游产生部分重叠,但在下游却通过两条不同的信号转导支路分别诱发飞廉细胞死亡和黄酮类物质的合成,而BI-1蛋白则作用于盐胁迫诱导飞廉细胞死亡信号转导通路的下游。