BI-1对紫外光诱发飞廉悬浮细胞凋亡和黄酮合成积累的影响及其信号转导机制研究

摘要

制约药用植物细胞培养生产重要次生代谢产物技术的产业化应用的瓶颈主要有两点：一是药用植物细胞生长缓慢，生物量低；二是培养细胞的次生产物合成的产量很低。研究探讨药用植物细胞次生产物合成途径调控机制对解决植物培养细胞次生物质的低产问题具有重要理论和实际指导意义。次生产物是药用植物在长期进化中适应环境的产物，在环境胁迫条件下，药用植物会产生具有保护作用的次生产物来提高环境适应力，因此利用逆境胁迫来诱导次生代谢产物合成是提高植物次生代谢产物的一个重要方法。 逆境胁迫对药用植物品质(次生物质合成积累)和产量有着双重影响，即逆境对产量和品质有双刃剑作用，而这种矛盾通过普通的栽培和管理措施是难以协调和解决的。BI-1基因是一个对细胞凋亡有广泛抑制作用的因子，可以抑制由Bax介导或非Bax介导的细胞凋亡过程。为了研究探讨BI-1基因对逆境诱发药用植物细胞凋亡和次生产物合成的影响，本文以本实验构建保存的转BI-1基因飞廉细胞(Est诱导型启动子)为材料，研究了BI-1基因表达对UV诱发飞廉细胞凋亡和次生产物合成的影响，并探讨了UV诱发飞廉细胞凋亡和次生产物合成的信号转导机理，为从分子水平上协调逆境影响中药材品质和产量的矛盾提供新的思路和策略。主要实验结果如下： (1)转BI-1基因飞廉悬浮细胞系的建立 将固体培养的转BI-1基因飞廉细胞接种到MS培养液中，为获得稳定且最优生长和黄酮类次生产物含量较高的培养条件，对培养液组成成分、pH值、蔗糖浓度、培养温度、摇床转速和接种量等条件进行优化，得到了飞廉悬浮细胞最适的培养条件：培养液为MS+1×10-5 mol·L-1 NAA+2×10-6mol·L-1 BA+3％蔗糖，-pH为5.8，培养温度25℃，摇床转速110 rpm，接种量为3 g/50mL medium。且飞廉细胞生长周期为14 d。在优化培养过程中，定期对飞廉悬浮细胞进行PCR验证及抗生素筛选，经过多次传代，获得分散性较好、生长较快且黄酮类次生产物含量较稳定的转BI-1基因飞廉悬浮细胞系。 (2)UV胁迫诱发飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成 UV胁迫处理的飞廉细胞经Sytox特异性核酸染色观察到细胞凋亡现象，且随着时间的延长，细胞死亡率逐渐增高，在UV胁迫后第36 h荧光下观察到染色质凝聚现象，第72h观察到染色质基本成弥散状等形态学上典型的细胞凋亡特征现象，而对照组细胞在荧光下无成像。DNA琼脂糖凝胶电泳结果也表明，UV胁迫处理飞廉细胞后第48 h出现DNA片段化，表现为明显的DNA ladder现象，而对照组则为一条明显的主带。这些结果都表明UV胁迫诱发了飞廉细胞凋亡。 对处于生长周期不同阶段的飞廉细胞进行UV胁迫处理，发现飞廉细胞生长对数期(第11 d)为UV胁迫促进飞廉细胞黄酮类次生产物合成积累的最佳时期，第14 d收获的细胞鲜重达到对照的93.8％，黄酮类次生产物含量达到了对照的2.69倍，表明UV胁迫可以诱发飞廉细胞黄酮类次生产物的合成积累。 (3)NO参与介导UV胁迫诱导飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成 为了探讨UV胁迫诱导飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成的信号转导机理，本文测定了UV处理后飞廉细胞中NO的含量。数据显示，UV胁迫处理后10 h，飞廉细胞中NO含量开始出现增加，并在18 h出现第一次高峰，随后有所下降，在处理后第32 h出现第二次跃迁，NO含量在第38 h达到第二个高峰，且第二次进发的NO含量高于第一次，表明UV胁迫诱发飞廉细胞内的NO进发。通过添加NO淬灭剂cPITO发现，在NO被清除的同时UV胁迫诱导的飞廉细胞凋亡受到抑制，黄酮类次生产物合成亦受到一定程度的抑制。表明NO同时参与UV胁迫诱发的飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成调控途径。 (4)BI-1基因表达对UV胁迫诱导飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成积累的影响 Western blotting检测结果表明，添加20μmol·L-1雌二醇(Est)可以诱导转BI-1基因飞廉细胞中BI-1的稳定表达。实验结果显示Est诱导BI-1基因表达对正常培养条件下的转基因飞廉细胞无影响，与野生型飞廉细胞在细胞生长和黄酮类次生产物合成积累上也没有明显区别。而在UV胁迫前添加Est诱导BI-1基因表达，发现BI-1基因表达对UV胁迫诱发的细胞凋亡有明显的抑制作用，但对UV胁迫诱发的黄酮类次生产物合成和NO积累没有影响。表明NO可能依赖不同的信号转导途径分别参与UV胁迫诱导飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成。 综上所述，本文实验结果表明：(1)UV处理可以分别诱发飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物的合成积累；(2)NO同时参与UV胁迫诱发飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成积累的信号转导过程：(3)NO是UV诱发飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成积累的共用信号分子，但是在NO的下游UV却可以通过两条不同的信号转导支路分别诱发飞廉细胞凋亡和黄酮类次生产物合成，而且在UV诱发细胞凋亡的信号转导支路中存在着BI-1基因的特异性作用位点。上述研究结果为利用BI-1基因对药用植物品质和产量进行分子调控提供了理论依据，相关研究目前仍在进行中。

目录

文摘

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声明

第1章 引言

1.1植物细胞培养法生产天然产物的研究现状

1.2植物细胞凋亡的研究现状

1.3 NO在植物体内的信号分子作用研究现状

1.4本论文的研究思路和主要研究内容

第2章转BI-1基因飞廉悬浮细胞培养条件的优化

2.1前言

2.2材料、试剂和实验仪器

2.3实验方法

2.4实验结果

2.5讨论

第3章 UV胁迫诱发飞廉悬浮细胞凋亡和对次生产物合成的影响

3.1前言

3.2材料、试剂和实验仪器

3.3实验方法

3.4实验结果

3.5讨论

第4章 参与UV胁迫诱发飞廉细胞死亡和次生产物合成的信号转导研究

4.1前言

4.2材料、试剂和实验仪器

4.3实验方法

4.4实验结果

4.5讨论

第5章BI-Ⅰ基因的诱导表达对UV胁迫诱发飞廉细胞凋亡和次生产物合成的影响及其信号转导机理研究

5.1前言

5.2材料、试剂和实验仪器

5.3实验方法

5.4实验结果

5.5讨论

第6章结论

参考文献

附录

致谢