Pleurotus eryngii-co007产木质素降解酶条件的优化及对染料降解的研究

摘要

刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)是一种具有较强木质素降解能力的白腐真菌，隶属于真菌门、担子菌亚门、真担子菌纲、层菌亚纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。木质素降解酶是参与木质素生物降解过程中的酶类，具有高氧化降解能力和多底物性，能够降解木质素、多环芳烃类化合物、杂环类化合物和合成染料等多种难降解有机物。本文对Pleurotus eryngii-Co007木质素降解酶的产酶条件进行优化、并对其酶学性质和染料降解效果开展系统研究，为今后将其应用于环境保护、生物漂白与制浆、食品工业等领域提供理论和实践依据。
　　 通过初始pH、秸秆、吐温-80和铜离子的单因素实验和中心组合响应面优化考察了影响Pleurotus eryngii-C0007菌株产木质素降解酶的因素，得到液态发酵产木质素降解酶的最佳条件。在此基础上，开展3L上罐参数优化，结果表明在25℃，150r/min,0.8vvm溶氧的条件下，培养10天，发酵液中酶活最高达到691.04U/mL，较摇瓶培养提高了1.86倍。同时对Pleurotus eryngii-C0007菌丝体的再次利用产木质素降解酶进行了研究，在pH5.8的缓冲体系，菌丝体产酶效果最好，能再利用两次。菌丝体在三次利用的缓冲液体系，酶活最高可达到565.04U/mL。
　　 为了提高割胶纯化的回收率，分析了超声处理对Native-PAGE中活性目标蛋白回收的影响。根据单因素实验结果，采用响应面分析法的Central Composite进行实验设计，得到的最佳超声条件为超声时间188.40min、超声功率76.31W。在此条件下，Native-PAGE中活性目标蛋白回收率达40.03％，与回归模型的预测值相对误差仅1.11％，回归方程与实际情况拟合较好。
　　 对Pleurotus eryngii-C0007木质素降解酶粗酶及单一组分芳基乙醇酶AAO-Pec0007的酶学性质进行了考察。以ABTS为底物，刺芹侧耳木质素降解酶粗酶的酶学性质如下：最适催化pH为3.0，在pH为4.0时稳定性最好，残余酶活高达91.8％；最适催化温度为15℃，最适稳定温度为10℃；Zn2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+对粗酶的催化有一定的促进作用，Mn2+的促进作用最大；K+、Ca2+、Ag+、Na+、Fe2+、Mg2+对粗酶的催化有一定的抑制，Fe2+的抑制最强；氧化ABTS的动力学参数Vmax和Km分别为714.29U/mg和1.5mM。以VA为底物，AAO-Pec0007的酶学性质如下：最适催化pH为6.0，在pH为7.4时稳定性最好，残余酶活高达93％;最适催化温度为70℃，最适稳定温度为20℃；测试金属离子没有促进作用，其中的Zn2+、Fe2+、Cu2+这三种金属离子对AAO-Peco007酶活力有明显抑制作用；氧化VA的动力学参数Vmax和Km分别为80U/mg和0.921mM。
　　 采用Pleurotus eryngii-C0007木质素降解酶粗酶对四种不同类型的染料进行脱色试验，结果表明溴酚蓝＞刚果红＞靛蓝＞亚甲基蓝。对脱色影响因素进行研究，以2h染料脱色体系为例，在脱色温度30℃、pH4.0、H2O25μmol/L、粗酶浓度20U/mL、溴酚蓝浓度10mg/L的条件下，溴酚蓝脱色效率最高，脱色率为89.56％，小分子介体物质ABTS对溴酚蓝脱色体系脱色率无促进；在脱色温度30℃、pH4.6、H2O210μmol/L、ABTS2.5μmol/L、粗酶浓度20U/mL、靛蓝浓度100mg/L的条件下，靛蓝脱色效率最高，脱色率为50.47％;在脱色温度40℃、pH4.8、H2O22.5μmol/L、ABTS2.5μmol/L、粗酶浓度20U/mL、刚果红浓度100mg/L的条件下，刚果红脱色效率最高，脱色率为54.72％;对亚甲基蓝染液的脱色率在24h时达到10.12％。
　　 采用AAO.Peco007单一组分对四种不同染料进行脱色试验，结果表明刚果红＞溴酚蓝＞靛蓝＞亚甲基蓝(亚甲基蓝不分解)。对脱色影响因素进行研究：以2h染料脱色体系为例，在脱色温度40℃、pH4.2、H2O210μmol/L、AAO. Pec0007浓度20U/mL、溴酚蓝浓度10mg/L的条件下，溴酚蓝脱色效率最高，脱色率为25.69％，小分子介体物质ABTS对溴酚蓝脱色体系脱色率无促进；在脱色温度30℃、pH4.2、H2O210μmol/L、ABTS2.5μmol/L、AAO-Pec0007浓度20U/mL、靛蓝浓度100mg/L的条件下，靛蓝脱色效率最高，脱色率为24.57％;在脱色温度40℃、pH5.2、H2O22.5μmol/L、ABTS2.5μmol/L、AAO-Peco007浓度20U/mL、刚果红浓度100mg/L的条件下，刚果红脱色效率最高，脱色率为48.31％。
　　 在上述基础上，采用Box-Behnken试验的响应面法进一步优化Pleurotus eryngii-C0007木质素降解酶粗酶对蒽醌类染料靛蓝和偶氮类染料刚果红脱色条件，结果表明在pH4.60、30℃、ABTS2.85μmol/L的条件下，木质素降解酶粗酶对靛蓝的的脱色率为49.98％;在pH4.81、40.15℃、ABTS2.96μmol/L的条件下，木质素降解酶粗酶对刚果红的脱色率为53.93％。

目录

文摘

英文文摘

第1章 前言

1.1 白腐真菌的微生物学特征及分类

1.2 木质素降解酶的种类

1.2.1 木质素过氧化物酶LiP

1.2.2 漆酶Lac

1.2.3 锰过氧化物酶MnP

1.2.4 芳基醇过氧化物酶AAO

1.2.5 多功能过氧化物酶VP

1.3 侧耳属白腐真菌分泌的重要木质素降解酶

1.4 白腐菌木质素降解酶培养条件优化的研究进展

1.4.1 碳源、氮源对白腐菌产木质素降解酶的影响

1.4.2 金属离子对白腐菌产木质素降解酶的影响

1.4.3 诱导剂对白腐菌产木质素降解酶的影响

1.4.4 表面活性剂对白腐菌产木质素降解酶的影响

1.4.5 其他因素对白腐菌产木质素降解酶的影响

1.5 木质素降解酶在染料废水降解方面的应用

1.5.1 染料的分类

1.5.2 染料废水的处理技术

1.5.3 白腐菌处理染料废水

1.6 本课题的研究目的和研究内容

1.6.1 研究目的及研究思路

1.6.2 研究内容

第2章 刺芹侧耳Pleurotus eryngii-C0007产木质素降解酶条件的优化

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果及讨论

2.2.1 响应面设计优化发酵条件

2.2.2 菌丝体的多次利用产酶

2.2.3 Pleurotus eryngii-C0007产酶上罐发酵参数的优化

2.3 本章小结

第3章 刺芹侧耳Pleurotus eryngii-C0007木质素降解酶组分的获得和酶学性质的研究

3.1 材料和方法

3.1.1 药品、试剂与主要仪器设备

3.1.2 实验方法

3.2 结果及讨论

3.2.1 割胶纯化条件的优化

3.2.2 Pleurotus eryngii-C0007木质素降解酶粗酶的酶学性质

3.2.3 Pleurotus eryngii-Co007的AAO-Pec0007酶学性质

3.3 本章小结

第4章 刺芹侧耳Pleurotus eryngii. Co007木质素降解酶对染料降解的初步研究

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 不同染料的扫描图谱和标准曲线

4.2.2 Pleurotus eryngii-C0007木质素降解酶粗酶和芳基醇氧化酶AAO-Pec0007对染料的脱色研究

4.2.3 响应面法优化Pleurotus eryngii-Co007木质素降解酶粗酶对染料脱色的条件

4.3 本章小结

第5章 结果与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录 研究生期间发表的论文

致谢