养殖大黄鱼和海水鲈鱼冷藏过程中特定腐败菌的鉴别

摘要

我国是水产品产量居世界第一的水产品大国，养殖大黄鱼和海水鲈鱼是我国沿海居民常用的食用鱼种。因其肉质鲜嫩味美，富含人体必需氨基酸及丰富的维生素，倍受欢迎。然而，由于两种养殖海水鱼富含蛋白质和脂肪酸，尤其是不饱和脂肪酸含量较高，肌肉组织较松软，蛋白酶活性较强，鲜活鱼捕捞死亡后，僵直期较短，鱼体的新鲜度很快下降。另一方面，随着经济的发展，生活水平的提高和人口素质的提高，国内外市场对水产品的质量与安全、水产品品质和鲜度提出更高的要求。因此，如何保持海水鱼在低温流通过程中品质和鲜度该目前的水产品保鲜技术提出了很大挑战。而水产品贮藏过程中体内内生酶和微生物的繁殖是引起品质劣变的主要原因，鱼类的腐败主要是微生物的活动引起的。因此研究水产品贮藏过程中的微生物菌群变化，查明特定腐败菌，是进行品质变化监控和抑制水产鱼类腐败变质的前提和基础。
　　 鉴于此，本文通过感官品评、理化指标、微生物培养方法和分子生物学技术系统评价了养殖大黄鱼和海水鲈鱼在冷藏条件下品质的劣变规律和细菌群落变化趋势;通过腐败能力分析确定了产H2S菌株均质是引起两种鱼类腐败变质的优势腐败菌，并进一步分离和鉴定了特定腐败菌，研究为后续特定腐败菌的致腐机制和靶向抑制研究奠定了良好的基础。主要结论如下:
　　 1、养殖大黄鱼和海水鲈鱼在冷藏期间，贮藏温度对两种海水鱼的品质具有显著影响，其中冰温贮藏-2℃比4℃能更好的保持鱼体的鲜度，具有降低感官评分、pH、K值和TVB-N的积累，延缓了细菌的增殖，养殖大黄鱼和海水鲈鱼在-2℃比在4℃下货架期延长了7d。在冷藏期间养殖大黄鱼比海水鲈鱼更容易腐败，4℃条件下海水鲈鱼比养殖大黄鱼的保鲜期延长3d，-2℃下海水鲈鱼的货架期比养殖大黄鱼延长7d，可能是养殖大黄鱼比海水鲈鱼肉质更细腻，蛋白含量更高，有利于细菌繁殖，导致组胺等不良气味和异味迅速积累。采用选择性培养基分析了两种养殖海水鱼在冷藏期间5种细菌的变化，随着贮藏时间的延长，细菌总数显著增加，冰温贮藏能显著延缓细菌的增长，其中LA比PCA更适合用于海水鱼类的细菌总数评价;产H2S菌株、假单胞菌和明亮发光杆菌与细菌总数增长趋势相似，其中产H2S菌株增长最快，而乳酸菌和肠杆菌增长较缓慢。
　　 2、建立了PCR-DGGE分析养殖大黄鱼和海水鲈鱼的冷藏过程中菌群动态变化的检测技术，通过测序方法鉴定了两种养殖鱼类中优势腐败菌。PCR-DGGE图谱区系多样性分析显示，两种养殖鱼类随着贮藏时间的延长，DGGE图谱的多样逐步增加，优势条带信号强度增强;同一品种鱼在不同贮藏温度下，表现相似的多样性变化，而不同品种的DGGE图谱具有明显的差别;LH和PCA培养方法比直接抽提法能获得更多的优势菌种条带，并且带明亮度高。测序结果显示，养殖大黄鱼冷藏过程中主要细菌为希瓦氏菌和假单菌属，在测序菌株分别占50％和40％，而海水鲈鱼冷藏过程中主要细菌也是希瓦氏菌和假单菌属，在测序菌株分别占40％和20％，但两种海水鱼中的分离株不同。因此PCR-DGGE和选择性培养方法得到的结果较一致，两种海水鱼类冷藏过程中优势菌群是产H2S菌株菌和假单胞菌属。
　　 3、通过感官品评分析了接种产H2S菌株、假单胞菌和明亮发光杆菌的无菌鱼块在冷藏过程中的腐败特征，结果显示产H2S菌株腐败能力最强，假单胞菌和明亮发光杆菌次之，其中产H2S菌株和假单胞菌出现明显的臭味等腐败味，而明亮发光杆菌主要引起表皮色泽的改变。因此，产H2S菌株是引起两种养殖鱼类品质劣变的优势腐败菌。进一步评价了产H2S菌株各个分离菌株的腐败特征，结果显示产H2S菌株的12个分离株菌具有较强的腐败能力，其中养殖大黄鱼XH6和海水鲈鱼XL4腐败能力最强，通过分析TVB-N、TMA和腐败菌数，与感官变化趋势一致，确定了产H2S菌株XH6和XL4是特定腐败菌。
　　 4、通过革兰氏染色、生理生化和16SrDNA技术鉴定了产H2S菌株XH6和XL4，两个菌株均为G-杆菌，生化和16SrDNA结果一致，特定腐败菌XH6和XL4为腐败希瓦氏菌。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 水产品微生物研究现状分析

1．1．1 水产品中的微生物形态学

1．1．2 水产品特定腐败菌

1．1．3 水产品特定腐败菌的分类、鉴定和抑制

1．2 水产品菌相多样性的研究

1．2．1 Rep-PCR指纹分析技术

1．2．2 PCR-DGGE和PCR-TGGE

1．2．3 PCR-RFLP技术

1．2．4 Biolog微孔板鉴定系统和显色培养基

1．3 本课题研究目的及意义

第2章 养殖大黄鱼和海水鲈鱼冷藏过程中品质变化与评价

2．1 前言

2．2 试验材料与主要仪器

2．2．1 试验材料

2．2．2 主要仪器

2．3 试验方法与步骤

2．3．1 试验材料及其预处理

2．3．2 感官评价

2．3．3 理化指标

2．3．4 微生物分析方法

2．3．5 数据处理

2．4 结果与分析

2．4．1 感官评价

2．4．2 K值

2．4．3 挥发性盐基氮

2．4．4 pH值

2．4．5 细菌总数

2．4．6 产H2S的菌株

2．4．7 假单胞菌

2．4．8 明亮发光杆菌

2．4．9 乳酸菌

2．4．10 肠杆菌

2．5 本章小结

第3章 PCR-DGGE研究养殖大黄鱼和海水鲈鱼冷藏过程中细菌菌群变化

3．1 前言

3．2 试验材料与主要仪器

3．2．1 试验材料

3．2．2 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 样品处理

3．3．2 样品中总基因组DNA的提取

3．3．3 PCR扩增

3．3．4 PCR-DGGE电泳

3．3．5 DGGE胶清晰明亮条带的割胶、回收DNA

3．3．6 数据处理

3．4 结果与分析

3．4．1 细菌总DNA的PCR扩增结果

3．4．2 细菌的DGGE图谱分析

3．4．3 测序结果分析

3．5 本章小节

第4章 养殖大黄鱼和海水鲈鱼特定腐败菌的分离鉴定

4．1 前言

4．2 材料与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 样品预处理

4．3．2 特定优势腐败菌的筛选：感官评价

4．3．3 特定腐败菌的腐败能力的鉴定

4．3．4 特定腐败菌的鉴定

4．3．5 数据处理

4．4 结果与讨论

4．4．1 优势腐败菌的评价

4．4．2 特定腐败菌的感官评价

4．4．3 特定腐败菌的腐败能力分析

4．4．4 特定腐败菌的鉴定

4．5 本章小结

第5章 总结、创新点与展望

5．1 总结

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录1

附录2

致谢

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