冷藏养殖大黄鱼特定腐败菌及其群体感应信号分子DKPs鉴定与功能的研究

摘要

微生物是绝大多数水产品腐败变质的主要因素。但是，只有小部分产生不良气味和有毒有害物质的微生物能够引起水产品腐败，被称为特定腐败菌。在贮藏过程中，特定腐败菌会随着贮藏条件的不同而表现出多样性。低温贮藏中水产品的特定腐败菌是希瓦氏菌属（Shewanella spp.）和假单胞菌属（Pseudomonas spp.）。近几年，希瓦氏菌属因其在鱼及鱼制品中表现出的腐败能力而被广泛关注，它是一类革兰氏阴性菌，能够产生H2S，具有运动性。
　　群体感应信号分子具有密度依赖性，在腐败菌中它能够调控特定的基因表达致使食品腐败。因此，本文的研究目的是鉴定养殖大黄鱼在4℃低温贮藏中的特定腐败菌，并用GC-MS方法检测该特定腐败菌的群体感应信号分子。该研究为将来创造新的水产品保鲜剂提供了新的思路与途径。
　　本论文的研究内容包括以下3个部分:
　　1.从4℃空气包装养殖大黄鱼中共分离得到102个菌株，74株(72.5％)为产H2S的菌株。通过传统的生化分析和16S rDNA的分子标记鉴定，74株中有60株菌(81.1％)是希瓦氏菌属，其中Shewanella baltica48株(64.9％)，剩下的14株菌(18.9％)为气单胞菌属（Aeromonas）和肠杆菌属（Enterobacteriaceae）。因此，低温贮藏养殖大黄鱼的特定腐败菌是S.baltica。
　　2.48株不同的S.baltica分别接种于无菌鱼汁中，通过测定挥发性盐基氮和感官分析（气味）来评估其腐败能力。所有的结果表明，S.baltica025的腐败能力大于其他所有的菌株，S.baltica003的腐败能力小于其他所有的菌株，由此可见，不同的S.baltica菌株的腐败能力不同。为了从基因上找出两菌株的差异，更好地理解其在水产品腐败上的原理依据，进一步的研究是测定S. baltica003和S.baltica025两菌株的全基因，并通过16S rDNA分析发现S.baltica003为S.baltica OS223，S.baltica025为S.baltica OS185。经过两个菌株全基因的比较发现氧化三甲胺还原酶，胱氨酸合成酶和生物胺类合成酶存在基因上的差异性。
　　3.通过气质联用从具有最强腐败能力的S.baltica025的培养液中分离鉴定得到四种具有群体感应信号分子作用的二酮哌嗪类化合物。在S.baltica025培养液中添加化学合成的四种 DKPs(cyclo-(L-Pro-L-Gly)，cyclo-(L-Pro-L-Leu)，cyclo-(L-Leu-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe))，以此获得了添加不同诱导物的细菌S.baltica025代谢产物粗提液，再将此类粗提取物接种于无菌养殖大黄鱼鱼汁中，定期对其进行挥发性盐基氮(TVB-N)测定。结果表明鱼汁经过5天贮藏后实验组相较于空白组腐败明显，经cyclo-(L-Pro-L-Phe)处理后的鱼汁腐败最明显，而经cyclo-(L-Pro-L-Leu)处理后的鱼汁腐败最弱，说明DKPs对S.baltica的腐败活性具有正调控作用。本研究首次在S.baltica菌中检测到DKPs类化合物，为其在水产品腐败微生物发挥致腐功能提供一定的依据。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 鱼类腐败及其贮藏保鲜技术研究进展

1．1．1 鱼类腐败

1．1．2 鱼类特定腐败菌

1．1．3 鱼类贮藏保鲜技术的研究进展

1．2 细菌群体感应系统的研究概述

1．2．1 群体感应的概念

1．2．2 群体感应的信号分子

1．2．3 群体感应信号分子检测方法

1．2．4 群体感应抑制剂

1．2．5 群体感应在食品及水产品防腐保鲜上的研究进展

1．3 本文研究的目的和意义

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究意义

第2章 冷藏大黄鱼特定腐败菌的分离与鉴定

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 原料的采集与处理

2．2．2 实验试剂与设备

2．3 实验方法

2．3．1 大黄鱼中腐败菌的分离

2．3．2 细菌鉴定方法

2．3．3 数据分析方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 养殖大黄鱼初始腐败菌相分离

2．4．2 生理生化鉴定

2．4．3 特定腐败菌鉴定与系统发育树的构建

2．5 本章小结

第3章 特定腐败菌Shewanella baltica中最高腐败能力菌株筛选及其基因分析

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株

3．2．2 原料的采集

3．2．3 实验试剂与设备

3．3 实验方法

3．3．1 细菌菌悬液的制备

3．3．2 无菌鱼汁的制备

3．3．3 接种与贮藏实验

3．3．4 全基因测序

3．3．5 数据处理与分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 腐败能力检测结果

3．4．2 全基因测序结果初步分析

3．5 本章小结

第4章 新鲜养殖大黄鱼特定腐败菌Shewanella baltica OS185中DKPs信号分子的探究

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株及保藏

4．2．2 原料的采集

4．2．3 实验试剂与设备

4．3 实验方法

4．3．1 S．baltica OS185菌株生长曲线的绘制

4．3．2 细菌S．baltica OS185代谢产物粗提取液的制备

4．3．3 GC-MS法检测DKPs

4．3．4 DKPs的化学合成

4．3．5 HPLC-MS法验证Fmoc固相多肽合成的化合物DKPs

4．3．6 DKPs诱导细菌腐败的能力检测

4．3．7 数据处理与分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 细菌S．balticaOS185的生长曲线绘制

4．4．2 GC-MS法检测DKPs结果分析

4．4．3 HPLC-MS法验证Fmoc固相多肽合成的化合物DKPs

4．4．4 DKPs诱导细菌生产腐败因子的能力检测

4．5 本章小结

第5章 结论、创新点及展望

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

附录1

附录2

硕士期间完成的论文

致谢

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