植物乳杆菌ZJ316产细菌素遗传性状改造的初探

摘要

群体感应系统(quorum sensing，QS)是细胞浓度决定性网络系统，它调控着细胞内很多复杂的代谢过程。1970年，科学家在费氏弧菌中首次揭示出了QS系统，随后很多革兰氏阳性菌与阴性菌的QS系统相继被揭示。在近些年，随着人们对QS系统研究的深入，人们也开始利用QS系统来为人类服务。
　　植物乳杆菌J316是一株具有良好抗菌活性的乳酸菌，与大多数乳酸菌一样，其细菌素产生也是通过QS调节的。通过全基因组测序，我们发现植物乳杆菌ZJ316的QS系统缺少反馈调节因子plnC/plnD基因。因此我们希望对植物乳杆菌ZJ316的QS进行改造，可以调控其细菌素的产量。
　　本实验已筛选得到了几株抑菌效果较好的植物乳杆菌，通过提取其基因组，并以此为模板进行PCR，确定目的基因plnC、plnD，并通过割胶回收获得目的基因。对目的基因进行双酶切，连接质粒PNZ8048，成功构建出重组质粒plnC-PNZ8048、plnD-PNZ8048，并保存于E.coli DH5α中保存。
　　植物乳杆菌ZJ316作为野生菌，其电转化条件并不明确，因此我们对植物乳杆菌J316电转化条件进行摸索，发现当细胞培养至OD6001.1，用10g/L溶菌酶37℃处理细胞1h，使用甘油/蔗糖溶液作为电转化缓冲液处理转化效率最高。通过最优条件，我们成功获得了plnC-PNZ8048-ZJ316、plnD-PNZ8048-ZJ316基因工程菌。通过对基因工程菌生长曲线的测定，我们发现质粒转化后，对菌体生长影响不是很明显，同时也为基因工程菌的诱导表达打下了一定的基础。
　　基因工程菌的生长曲线与野生菌相似，但它们的诱导表达条件还是有所不同，因此需要进行正交实验。实验结果表明，最优诱导条件是在MRS液体培养基中加入15 ng/mL氯霉素，并在30℃培养，至OD6000.4加入2 ng/ml Nisin诱导16h，发现在27K Da附近出现了目的条带。进一步通过抑菌实验发现，plnC-PNZ8048-ZJ316对柠檬色葡萄球菌的抑制效果与野生菌并没有明显的差别，plnD-PNZ8048-ZJ316对柠檬色葡萄球菌的抑制效果有明显的下降。PlnC、PlnD作为一对反馈调节因子，可以调节细菌素的产生，PlnC作为激活因子，并没有对细菌素的产生有明显的激活作用，而PlnD却展现出了其一定的抑制作用，基因工程表达虽然可以让我们单独研究PlnC、PlnD的作用，但是还是具有一定的缺陷，其表达产物或多或少会带有多余的氨基酸序列，从而可能会影响目的蛋白的功能。
　　虽然我们初步确定了PlnC、PlnD的功能，但是由于基因工程的缺陷，PlnC并没有出现预想的结果，同时我们也未得到更高抑菌活性的植物乳杆菌。植物乳杆菌ZJQ的抑菌活性也具有不错的抑菌活性，因此我们希望可以通过原生质体融合技术，改造植物乳杆菌ZJ316。原生质体融合技术是一种可以快速高效的改变微生物性状的生物技术手段，它有着其他技术无可比拟的优势，可以克服种间的不育性，使融合子同时具有双亲的优良性状。我们希望可以通过植物乳杆菌ZJ316与植物乳杆菌ZJQ进行融合，获得具有良好抑菌活性的植物乳杆菌。
　　通过原生质体融合技术，我们成功获得了融合子，并对融合子进行电镜观察，发现融合子细胞形态较野生菌株有所加长，且进行SDS-PAGE分析，发现融合子兼有两亲本的蛋白条带，可以证明两菌株成功融合，进行抑菌实验。实验结果发现，融合子的抑菌效果，相较两亲本有明显的提高。

目录

摘要

引言

第一章 绪论

1．1 群体感应系统简述

1．2 革兰氏阴性菌QS系统

1．3 革兰氏阳性菌QS系统

1．4 QS系统的应用

1．5 乳酸菌QS系统的研究现状

1．6 植物乳杆菌ZJ316的QS系统

1．6．1 plnA、plnB碱基比对

1．6．2 PlnA、PlnB氨基酸序列比对

1．6．3 plnA前结合位点

1．7 本实验研究的内容及目的

第二章 plnC、plnD重组质粒构建

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 试剂

2．1．4 溶液

2．1．5 引物

2．1．6 质粒

2．1．7 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 菌种活化

2．2．2 植物乳杆菌基因组提取

2．2．3 plnC、plnD基因确定

2．2．4 plnC、plnD基因的获得

2．2．5 质粒PNZ8048的提取

2．2．6 质粒PNZ8048与目的条带双酶切

2．2．7 沉淀法回收酶切产物

2．2．8 目的片段与质粒连接

2．2．9 E.coli DH5α感受态的制备

2．2．10 E.coli DH5α电转化

2．2．11 阳性菌筛选及鉴定

2．3 结果与讨论

2．3．1 阳性菌筛选及鉴定

2．3．2 目的条带获得

2．3．3 转化E.coli DH5α

2．3．4 PCR验证

2．3．5 酶切验证

2．3．6 测序结果

2．3．7 功能位点预测分析

2．3．8 目标蛋白的空间构象

2．4 本章小结

第三章 重组质粒转化植物乳杆菌ZJ316

3．1 实验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 试剂

3．1．4 溶液

3．1．5 引物

3．1．6 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 ZJ316菌种活化

3．2．2 ZJ316生长曲线的测定

3．2．3 不同生长期对转化效率的影响

3．2．4 不同细胞壁弱化剂对转化效率的影响

3．2．5 不同电转缓冲液对转化效率的影响

3．2．6 ZJ316感受态的制备

3．2．7 重组质粒提取

3．2．8 ZJ316电转化

3．2．9 阳性菌的筛选及鉴定

3．2．10 重组菌生长曲线的测定

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 植物乳杆菌ZJ316生长曲线

3．3．2 植物乳杆菌ZJ316电转化体系

3．3．3 PCR验证

3．3．4 重组菌生长曲线

3．4 本章小结

第四章 重组菌诱导表达、QS功能初步探索

4．1 实验材料

4．1．1 菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 试剂

4．1．4 溶液

4．1．5 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 基因工程菌诱导

4．2．2 诱导条件的优化

4．2．3 SDS-PAGE

4．2．4 抑菌实验

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 SDS-PAGE

4．3．2 抑菌实验

4．4 本章小结

第五章 原生质体融合改造植物乳杆菌ZJ316 QS系统

5．1 实验材料

5．1．1 菌种

5．1．2 培养基与溶液

5．1．3 溶液

5．1．4 试剂

5．1．5 引物

5．1．6 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 菌种活化

5．2．2 生长曲线的测定

5．2．3 原生质体预处理

5．2．4 原生质体融合

5．2．5 SDS-PAGE

5．2．6 电镜观察

5．2．7 抑菌活性的测定

5．2．8 融合子的PCR验证

5．3 结果与讨论

5．3．1 生长曲线的测定

5．3．2 原生质体形成率和再生率

5．3．3 融合结果

5．3．4 SDS-PAGE结果

5．3．5 菌体形态

5．3．6 抑菌实验结果

5．3．7 融合PCR验证

5．4 本章小结

第六章 总结

参考文献

致谢

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