利用重组大肠杆菌高效合成S-腺苷蛋氨酸的研究

摘要

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)，又名孓腺苷甲硫氨酸，在生物体内广泛存在，它的重要性仅次于ATP，是一种重要的生理活性物质，具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用，与核酸、蛋白质、磷脂质、神经递质以及维生素的合成紧密相关，并且它对肝病、抑郁症和关节炎等疾病有明显的治疗效果。
　　目前，SAM价格高昂且不能被广泛用于临床的原因，主要是因为其活力不足且不稳定，且只有(S，S)-SAM，也就是(-)-SAM才具有生物活性。SAM在我国的研究开发较晚，肝病和关节炎患者的市场需求又十分巨大。因此，利用合适的制备方法来提高SAM的产量，使其可以得到工业化大规模生产的意义非常大。
　　化学合成法、酶促转化法和发酵法这三种方法是SAM的主要生产方法。化学合成法产率低下，且底物又十分昂贵，况且从产物中分离出有活性的SAM比较困难，所以不用这类方法。酶促转化法在一定程度上提高了SAM合成酶的酶活，而且产物的无污染和纯度高等特点，体现了它的优势，但SAM合成酶在体内浓度较低，不易提取，而且ATP的成本高昂，这成为一大限制因素。近年来，以酵母为主的发酵法应用广泛，但是以大肠杆菌为表达系统的发酵法还是比较缺乏，本论文探索性尝试以重组大肠杆菌为菌种进行发酵，并且优化了发酵参数。
　　本课题首先以大肠杆菌BL21为表达系统，构建两种重组菌BL21-pET-28a-metK和BL21-pET-32a-metK，达到克隆S-腺苷蛋氨酸合成酶基因(metK)的效果，并从分子和蛋白质的角度分别证明已成功构建了重组载体pET-28a-metK和pET-32a-metK。
　　再利用HPLC对两种重组菌的SAM产量作了对比，得到高产菌株，命名为ZJGS-SAM，并选出发酵培养基成分和发酵条件中的六种因素，通过P-B实验从这六种因素中又得到了三个主要因素:酵母膏、装液量和pH，利用最陡爬坡实验得到了三个中心点的浓度，接着通过Box-Behnken Design实验得到一组可以使产量达到相对较高的一组培养基成分:乳糖20g/L，大豆蛋白胨40 g/L，酵母膏35g/L，NaCl10g/L，MgSO41.2 g/L，L-蛋氨酸1g/L;培养条件为初始培养基pH7.5，诱导温度33℃，接种量1％，转速220 rpm，装液量30 mL(250 mL摇瓶)。在优化条件的基础上发酵12h，对比未优化的35 mg/L原是产量，提高了271.4％。
　　通过上罐发酵进行验证，在分批发酵方式下，优化了pH条件和通气量的选择，产量达到87.88 mg/L，接着在分批补料发酵的方式下，采用了以乳糖为碳源的恒速流加的补料方式，提高了最终产量，达到了300.9 mg/L的浓度，并得到一组适合5L发酵罐生产的数据，从而为大量制备SAM奠定重要基础。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 SAM的背景

1．1．1 SAM的概况

1．1．2 SAM的代谢途径

1．2 SAM的研究进展

1．2．1 SAM的生物学功能

1．2．2 SAM的应用

1．2．3 SAM的制备方法

1．3 大肠杆菌表达系统

1．4 重组大肠杆菌的高密度发酵

1．4．1 宿主菌

1．4．2 质粒载体

1．4．3 培养条件

1．4．4 补料调控

1．4．5 生长抑制因子

1．5 研究目的及意义

1．6 研究思路

1．6．1 metK基因的克隆

1．6．2 S-腺苷蛋氨酸高产菌株的构建

1．6．3 摇瓶发酵响应面优化培养基

1．6．4 高密度发酵初步探索

1．7 研究路线

第2章 重组载体的构建与筛选

2．1 材料与仪器

2．1．1 菌株和载体

2．1．2 主要试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 主要仪器和设备

2．2 实验方法

2．2．1 metK基因的克隆

2．2．2 重组载体pET-28a-metK的构建

2．2．3 重组载体pET-28a-metK的鉴定

2．2．4 重组载体pET-32a-metK的构建

2．2．5 重组载体pET-32a-metK的鉴定

2．2．6 两种BL21重组菌中metK基因的诱导表达鉴定

2．3 结果与讨论

2．3．1 质粒提取

2．3．2 metK基因的获取

2．3．3 两种载体与metK基因的双酶切

2．3．4 两种重组载体的构建

2．3．5 两种重组载体的筛选与鉴定

2．3．6 两种重组载体的测序结果分析

2．3．7 两种BL21重组菌的蛋白电泳结果

2．4 本章小节

第3章 高产菌株的筛选与培养基的优化

3．1 材料与仪器

3．1．1 菌株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 培养基

3．1．4 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 两种重组菌发酵生产SAM

3．2．2 通过HPLC测定SAM的产量

3．2．3 培养基成分的优化

3．2．4 培养条件的优化

3．2．5 响应面优化培养基

3．3 结果与讨论

3．3．1 SAM的标准曲线

3．3．2 生长曲线

3．3．3 SAM高产菌株的筛选

3．3．4 培养基成分的优化结果

3．3．5 培养条件的优化结果

3．3．6 响应面优化的结果

3．4 本章小节

第4章 重组菌ZJGS-SAM高密度发酵的初步探索

4．1 材料与仪器

4．1．1 菌株

4．1．2 主要试剂

4．1．3 培养基

4．1．4 主要仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 分批发酵培养

4．2．2 分批补料发酵

4．3 结果与讨论

4．3．1 分批发酵培养

4．3．2 分批补料发酵

4．4 本章小节

第5章 结论与展望

5．1 结论

5．1．1 两种重组载体的成功构建

5．1．2 ZJGS-SAM的筛选和培养基的优化

5．1．3 重组菌高密度发酵的初步探索

5．2 创新点

5．3 不足与建议

参考文献

已发表文章

致谢

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