基于DKP-LuxR的群体感应系统对Shewanella baltica腐败能力以及菌膜形成的调控研究

摘要

微生物生长代谢是引起水产食品腐败变质的主要原因。研究发现，并不是所有的微生物参与食品的腐败变质过程，实际上仅有少部分适合生存繁殖并产生腐败代谢产物的菌群参与这个过程，这类微生物被称为特定腐败菌(Specificspoilage organisms，SSO)。大黄鱼(Pseudosciaene crocea)因其高营养价值而深受人们喜爱，本课题组前期从冷藏大黄鱼中分离出Shewanalla baltica73号菌株，并且鉴定其为特定腐败菌。有研究认为群体感应系统(Quorum sensing，QS)参与调控S.baltica的腐败能力，然而S.baltica中具体QS系统（QS自体诱导物和QS受体蛋白）以及QS系统与腐败之间调控机制都还没有完全解明。为了确认S.baltica73号菌株的QS系统，通过NCBI BLAST比对，在S.baltica73号菌株中找到了6个luxR-type基因(luxR01，luxR02，luxR03，luxR04，luxR05和luxR06)，通过添加S.baltica73号菌株对数后期的培养上清液到对数前期进行诱导培养，研究发现除了luxR04其余5个luxR-type基因表达均显著上调，说明S.baltica73号菌株确实存在QS系统。通过UPLC-MS/MS检测，在S.baltica73号菌株纯培养物中检出了环二肽分子(diketopiperazines，DKP) cyclo-(L-Pro-L-Leu)(PL)、cyclo-(L-Leu-L-Leu)(LL)和cyclo-(L-Pro-L-Phe)(PP);在腐败的大黄鱼汁中检出了酰基高丝氨酸内酯类分子(acyl-homoserine lactone，AHL)N-butanoylhomoserinelactone(C4-HSL),N-hexanoylhomoserinelactone(C6-HSL),N-（3-oxotetradecanoyl）-homoserine lactone(3-oxo-C14-HSL)以及PL、LL和PP，其中DKPs占绝大部分，说明DKPs很有可能是S.baltica73号菌株QS系统自体诱导物。为了确认QS信号分子和QS受体蛋白的互作关系，本研究在E.coli BL21(DE3)中表达了6个LuxR家族蛋白，用ANTI-FLAG M2磁珠进行纯化，并将纯化的蛋白与上述检测到的信号分子混合物进行体外结合。最后，通过UPLC-MS/MS在LuxR01和LuxR02蛋白-信号分子结合系统中检出了PP，由此初步确认PP为S.baltica73号菌株的QS系统自体诱导物并能被其QS受体蛋白LuxR01和LuxR02识别。为了进一步验证各luxR-type基因在QS系统参与腐败调控中的作用，本研究构建了各luxR-type基因缺失株(SB7301，SB7302，SB7303，SB7304，SB7305和SB7306)，并对这些缺失株进行表型验证，发现与野生型相比，缺失株SB7301和SB7302三甲胺、腐胺和生物被膜的形成均显著下调，说明LuxR01和LuxR02蛋白对S.baltica73号菌株的腐败能力以及生物被膜起正调控作用。另外，为了研究基于第二信使c-di-GMP的菌膜相关基因bfp与S.baltica73腐败能力的关系，本实验构建了bfp基因缺失株SB7307，发现其三甲胺和腐胺产量较野生株显著下降。此外，转录组学分析以及荧光定量PCR验证显示torS、speF和pomA基因在转录水平上受LuxR01和LuxR02蛋白调控，而bfp基因的表达没有明显差异。为了进一步验证该DKP-LuxR型QS系统对S.baltica73号菌株腐败能力的影响，通过外源添加信号分子PP，发现野生株的三甲胺，腐胺和生物被膜的形成均显著增加，而缺失株SB7301和SB7302没有明显变化。
　　本课题首次在大黄鱼特定腐败菌S.baltica中在分子水平验证了QS系统的存在，确认了QS自体诱导物PP与QS受体LuxR01和LuxR02的特异性结合关系，并在转录水平确认了该QS系统对腐败能力和菌膜形成的正调控作用。此外，本研究首次从分子水平在S.baltica中发现独立于QS系统的基于基于第二信使c-di-GMP的菌膜相关基因bfp对S.baltica腐败能力的调控作用。本课题扩充了QS系统的组成及其生理学意义，为未来海产品保鲜剂的研发提供新靶点及新思路。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 海产品腐败

1．1．1 不同海产品的主要腐败微生物

1．1．2 海产品主要腐败代谢产物

1．2 细菌群体感应系统

1．2．1 群体感应分子互作机制

1．2．2 群体感应与食品腐败

1．2．3 群体感应与菌膜形成

1．2．4 群体感应淬灭

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究意义

第二章 特定腐败菌Shewanella baltica群体感应系统的确认

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 实验菌株及保藏

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 菌株的活化及培养

2．3．2 群体感应自我诱导实验

2．3．3 总RNA提取和纯度测定

2．3．4 基因组DNA的去除以及cDNA的合成

2．3．5 qRT-PCR特异性引物合成

2．3．6 荧光定量PCR(qRT-PCR)

2．3．7 数据处理与分析

2．3．8 S．baltica 73以及大黄鱼中AHLs和DKPs的提取

2．3．9 AHLs和DKPs标准溶液的配制

2．3．10 UPLC-MS／MS检测AHLs和DKPs

2．4 结果与讨论

2．4．2 S．baltica 73以及腐败大黄鱼中AHLs和DKPs的定性定量检测

2．5 本章小结

第三章 LuxR家族受体蛋白与AHLs和DKPs的特异性识别以及其对致腐能力和菌膜形成的调控

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 实验菌株及质粒

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 菌株的活化及培养

3．3．2 总RNA提取和纯度测定

3．3．4 特异性引物合成

3．3．5 细菌基因组DNA的提取

3．3．6 高保真PCR扩增

3．3．7 目的蛋白表达与分离纯化

3．3．8 LuxR家族蛋白与AHLs和DKPs的体外结合实验

3．3．9 UPLC-MS／MS检测LuxR家族蛋白结合的AHLs和DKPs

3．3．10 luxR家族基因以及菌膜相关基因bfp缺失株构建

3．3．11 三甲胺(TMA)测定

3．3．12 生物胺(腐胺)测定

3．3．13 菌膜测定

3．4 结果与讨论

3．4．1 LuxR家族蛋白表达与分离纯化

3．4．2 LuxR家族蛋白与AHLs和DKPs的特异性识别

3．4．3 luxR家族基因以及菌膜相关基因bfp缺失株构建

3．4．4 S．baltica 73各基因缺失株与野生株腐败能力比较

3．4．5 S．baltica 73各基因缺失株与野生株菌膜形成能力比较

3．5 本章小结

第四章 S．baltica 73中DKP-LuxR型QS系统调控其致腐能力及菌膜形成的通路挖掘

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 实验菌株及保藏

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 菌株的活化及培养

4．3．2 总RNA提取和纯度测定

4．3．3 原核链特异性转录组分析

4．3．4 荧光定量PCR特异性引物合成

4．3．5 荧光定量PCR(qRT-PCR)

4．3．6 数据处理与分析

4．3．7 外源添加cyclo-(L-Pro-L-Phe)后三甲胺、腐胺及菌膜测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 原核链特异性转录组分析

4．4．2 荧光定量PCR验证

4．4．3 外源cyclo-(L-Pro-L-Phe)对S．baltica 73野生株与缺失株SB7301和SB7302腐败能力的影响

4．4．4 外源cyclo-(L-Pro-L-Phe)对S．baltica 73野生株与缺失株SB7301和SB7302菌膜形成的影响

4．5 本章小结

5．1 结论

5．2 创新点

5．3 展望

参考文献

致谢

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