二化螟中肠Bt毒蛋白CrylAb受体基因的分子生物学研究

摘要

该论文以Bt 毒蛋白Cry1Ab 转基因水稻为材料,建立了从转基因植株中分离纯化外源基因表达产物 Cry1Ab 的二次高效液相离子色谱法;研究了处于有关缓冲溶液中的 Cry1Ab 蛋白构象性质及杀虫活性;以此为基础,用<'125>I标记二次色谱分离所得到的高纯度Cry1Ab蛋白,制得放射性探针;用该探针进行Western杂交实验证实了二化螟中肠存在Cry1Ab 受体蛋白;进一步用分子生物学有关方法克隆到二化螟中肠Cry1Ab 受体基因(Bt-R<,3>)cDNA全长序列,并在杆状病毒—昆虫系统中表达了Bt-R<,3>蛋白胞外结构域,Western点杂交实验显示表达产物能有效地结合Cry1Ab,从而确证所克隆到的Bt-R<,3>是Cry1Ab的受体基因;在这些研究的基础上,运用生物信息学手段分析了Bt-R<,3>蛋白的结构特性,Bt-R<,3>和文献已报导的几种Bt 受体蛋白之间的分子进化关系以及它们氨基酸序列间的保守性关系,从而更进一步地证实了Bt-R<,3>确实是Cry1Ab的受体基因.

目录

文摘

前言

致谢

缩略语

第一部分文献综述

第一章苏云金芽胞杆菌毒蛋白的分子生物学研究进展

第1节Bt杀虫晶体蛋白基因的分类

第2节Bt杀虫晶体蛋白的分子结构

第3节Bt杀虫晶体蛋白的分离与纯化

第4节Bt杀虫晶体蛋白基因的表达与调控

第5节Bt杀虫晶体蛋白的分子毒性机制

第6节Bt毒蛋白的植物基因工程

参考文献

第二章苏云金芽胞杆菌毒蛋白受体分子生物学研究进展

第1节氨肽酶类受体

第2节类钙粘蛋白受体

第3节受体蛋白与昆虫的抗性机制

第4节讨论

参考文献

第三章杆状病毒表达系统

第1节杆状病毒表达系统的基本原理

第2节常用的杆状病毒载体及昆虫细胞

第3节杆状病毒表达系统表达产物的修饰

第4节杆状病毒表达系统的优点和缺点

第5节杆状病毒表达系统的主要应用

参考文献

第二部分基本材料和方法

第1节材料

1.1供试昆虫

1.2菌种与载体

1.3工具酶

1.4试剂盒

1.5其它试剂

第2节方法

2.1 二化螟中肠总RNA的抽提

2.2琼脂糖凝胶电泳

2.3 PCR扩增产物中目的片段的分离回收(Glassmilk法)

2.4连接反应

2.5感受态细胞的制备

2.6连结产物转化感受态细胞及阳性克隆筛选

2.7质粒DNA的小量制备

2.8碱法大量制备质粒DNA

2.9重组质粒的筛选

2.10昆虫细胞培养

2.11重组杆状病毒的获得

2.12 Lipofectin共转染

2.13用于PCR鉴定的重组杆状病毒模板的制备

2.14 SDS-PAGE电泳

2.15 CrylAb杀虫毒性活性分析

第3节常用的分子生物学试剂配方

3.1细菌培养基

3.2质粒DNA抽提液

3.3琼脂糖凝胶电泳缓冲液

3.4常用缓冲液

3.5抗生素贮液

3.6 Western blot试剂

3.7其它试剂

参考文献

第三部分试验研究与结果分析

第四章高效液相离子色谱法从转基因水稻中分离、纯化Bt毒蛋白CrylAb的研究

第1节引言

第2节材料与方法

第3节结果与讨论

参考文献

第五章Bt毒蛋白CrylAb溶液构象的研究

第1节引言

第2节材料与方法

第3节结果与讨论

参考文献

第六章二化螟中肠CrylAb受体蛋白的鉴定、受体基因的克隆及其核苷酸序列特征

第1节引言

第2节材料与方法

第3节结果与讨论

参考文献

第七章Bt受体基因(Bt-R3)在杆状病毒—昆虫系统中的表达

第1节引言

第2节材料与方法

第3节结果与讨论

参考文献

第八章二化螟中肠Bt受体基因(Bt-R3)蛋白序列的生物信息学分析

第1节引言

第2节材料与方法

第3节结果与讨论

参考文献

总结

1论文研究的主要结论

2研究的主要创新点

3研究展望

附录

A攻读博士学位期间发表的论文情况

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