一种二化螟中肠干细胞的提取、分离及鉴定方法

摘要

本发明涉及一种二化螟中肠干细胞的提取、分离及鉴定方法，采用胶原酶I酶解，使中肠细胞从中肠壁上脱落下来，然后采用密度梯度离心法或流式细胞仪将干细胞与成肠细胞分离，本发明高效的得到了高纯度的二化螟中肠干细胞，可用于后续的干细胞功能研究。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫中肠细胞提取、分离及鉴定领域，尤其涉及一种二化螟幼虫中肠干细胞 的提取、分离及鉴定方法。

背景技术

昆虫中肠起源于内胚层，主要负责营养物质的吸收，由围食膜、中肠上皮细胞、基底膜 和肌肉层四部分组成。其中中肠上皮细胞包括：成肠细胞(柱状细胞和杯状细胞)、干细胞和 内分泌细胞。干细胞位于上皮细胞层的基底膜处，是夹在杯状或柱状细胞之间的一群小细胞， 它具有较强的更新能力，可以持续不断地增殖和分化来更替衰老或受损的旧细胞，产生肠道 所必须的子代细胞，从而使肠道具有强大的组织再生和修复能力。它在抵御病原物侵袭，维 持肠道上皮细胞在整个生命过程中的动态平衡起着重要作用(Amcheslavky A,Jiang J,Ip YT, 2009.Tissue damage-induced intestinal stem cell division in Drosophila.Cell Stem Cell.4:49-61； Hakim RS,Baldwin K,Smagghe G,2010.Regulation of midgut growth,development and  metamorphosis.Ann.Rev.Entomol.55,593-608)。

为了更深入的研究昆虫中肠干细胞的功能，首先需要将其从中肠中分离出来，最好的分 离方法是用对中肠干细胞具有特异性识别能力的组织免疫学标志物进行识别，然后再提取和 分离。目前，在该方面研究最为透彻的是模式昆虫—果蝇(Drosophila melanogaster)，转录调 节因子esg和delta均可作为特异性识别果蝇中肠干细胞的标志物(Ohlestein and Spradling, 2007.Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential Notch  signaling.Science.315:988-992)。但在鳞翅目昆虫中，目前还未找到特异性识别中肠干细胞的 有效标记物，这给干细胞的有效分离和准确鉴定带来了较大的技术难题。有研究表明，在烟 草天蛾(Manduca sexta)的蜕皮期，中肠干细胞与成肠细胞不粘连，且干细胞会快速大量分 裂、增殖，所以刚解剖的新鲜中肠片段放入培养基中孵育一段时间(40-60min)，期间并进行 震荡，就可使大量干细胞脱落下来，而柱状和杯状等成肠细胞因隔状结构彼此连接、固定， 不能快速脱落，进而通过过滤和离心的方法将其分离(Sadrud-Din S,Loeb M,Hakim R,1996.In  vitro differentiation of isolated stem cells from the midgut of Manduca sexta larvae.J.Exp.Biol., 199:319-325)。但该方法的缺点是：所获得的干细胞量非常少、纯度不高，并混杂有较多成 肠细胞。另有研究报道，根据干细胞与成肠细胞的形状和密度差异，加入Ficoll-Paque分离 液，进行密度梯度离心将其分离(Hakim RS,Caccia S,Loeb M,Smagghe G,2009.Primary  culture of insect midgut cells.In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.45:106-110)，该方法分离的干细胞 量较大且纯度较高。还有研究报道：基于中肠干细胞和成肠细胞对荧光染色剂的差异荧光反 应，可采用流式细胞分选术将烟芽夜蛾(Heliothis virescens)干细胞和成肠细胞分离(Castagnola  A,Eda S,Jurat-Fuentes JL,2011.Monitoring stem cell proliferation and differentiation in primar  midgut cell cultures from Heliothis virescens larvae using flow cytometry.Differentiation.1: 192-198)。由于昆虫中肠干细胞特别是鳞翅目昆虫干细胞的研究仍处于初步阶段，所以目前 还没有看到更有效的提取、分离和鉴定方法的报道。由于昆虫物种间的特异性差异，上述方 法并不能在任一物种中得以成功运用，还需要在目前研究的基础上对其进行改进和完善。

二化螟Chilo suppressalis(Walker)属鳞翅目、螟蛾科，是我国水稻上重要的常发性害 虫，给水稻生产造成了严重危害。目前，化学防治仍为控制二化螟的主要策略，但抗药性的 产生使二化螟防治效果显著下降。转Bt抗虫基因水稻的成功研制为二化螟的防治提供了新 策略，但二化螟对Bt水稻潜在的抗性风险是阻碍Bt水稻可持续应用的关键因素。有较多文 献报道，昆虫中肠干细胞的分化和增殖与该昆虫对Bt杀虫蛋白的抗性密切相关(Forcada C, Alcacer E,GarceráMD,Tato A,Martinez R,1999.Resistance to Bacillus thuringiensis Cry1Ac  toxin in three strains of Heliothis virescens:proteolytic and SEM study of the larval midgut.Arch. Insect Biochem.Physiol.42:51-63；Martinez-Ramirez AC,Gould F,Ferre J,1999. Histopathological effects and growth reduction in a susceptible and are resistant strain of Heliothis  virescens(Lepidoptera:Noctuidae)caused by sublethal doses of pure Cry1A crystal proteins from  Bacillus thuringiensis.Biocont.Sci.Technol.9:239-246；Hakim RS,Baldwin K,Smagghe G,2010. Regulation of midgut growth,development,and metamorphosis.Ann.Rev.Entomol.,55:593-608； Castagnola A,Eda S,Jurat-Fuentes JL,2011.Monitoring stem cell proliferation and differentiation  in primary midgut cell cultures from Heliothis virescens larvae using flow cytometry. Differentiation.1:192-198)。但中肠干细胞的分化和增殖是否与二化螟对Bt杀虫蛋白的抗性 密切相关，目前还未有报道。为了进一步深入了解中肠干细胞对二化螟抗性产生的调控作用， 从免疫学的角度解析二化螟对Bt杀虫蛋白的抗性机制，我们需要对该虫中肠干细胞的功能进 行系统研究。而开展该研究的第一步就是提取、分离和鉴定中肠干细胞，建立中肠干细胞纯 系，但目前还未有二化螟中肠干细胞提取、分离和鉴定方法的报道。通过本发明，我们建立 了二化螟中肠干细胞的提取、分离和鉴定技术，获得二化螟中肠干细胞纯系，为后期中肠干 细胞的功能研究奠定基础，同时还为其它鳞翅目昆虫中肠干细胞的研究提供借鉴经验。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种二化螟幼虫中肠干细胞的提取、分离及 鉴定方法。

二化螟幼虫中肠干细胞的提取、分离及鉴定方法，包括如下顺序步骤：

(1)对二化螟幼虫表皮进行消毒、解剖，取出中肠部分，

(2)将中肠剪成小段，用含有1％双抗、浓度为0.1％胶原酶I的PBS(pH7.4)溶液 彻底消化后，加入培养基工作溶液，依次用100目、200目细胞筛过滤，离心收集沉淀的细 胞，用培养基工作溶液制成细胞悬浮液，所述消化为在40℃水浴条件下，消化30-40min；

(3)将Ficoll-Paque分离液加入离心管中，上层再加入细胞悬浮液，4℃和600g条 件下，离心，最上层为干细胞；或者

(3’)在细胞悬浮液中加入荧光染色剂，孵育，用过滤网将细胞悬浮液过滤到流式管中， 然后用流式细胞仪分选并鉴定干细胞，采用单色荧光进行检测；

所述的培养基工作液是将格雷氏昆虫细胞培养液(Grace’s Insect Medium,TNM-FH, Catalog NO：04-501Q，Lonza公司)和林格氏液(Ringer’s Working Solution,Invitrogen公司) 以3:1的比例混合，并加入双抗(Antibiotic-Antimycoticotic,REF 15240-062,Lot 1393890)(100 ×)和硫酸庆大霉素(50mg/ml)，且其在培养基工作液中的浓度均为1.0％。

所述步骤(3)后上层干细胞倾出，加培养基工作溶液离心清洗。

所述离心清洗为低速短暂离心的方法，4℃和500g条件下，离心5min。

所述步骤(3)中的离心为4℃和600g条件下，离心15min。

所述消化期间每隔3min用手轻轻摇动一次离心管。

所述解剖为用两根昆虫针将幼虫的胸部和腹部末端固定在蜡盘上，先用剪刀分别在胸部 和腹部末端剪一下，然后从腹部剪口处沿着虫体剪向胸部剪口处，用镊子将中肠侧拉出来； 取出中肠，放入盛有林格氏液的培养皿中，用眼科镊去除马氏管、围食膜和食物残渣。

所述消毒为依次在次氯酸钠溶液中2-5min、70％或75％乙醇中2-5min和无菌ddH₂O2-5 min。

所述步骤(3’)中加入荧光染色剂的方法及用量为将细胞悬浮液稀释到2-5×10⁶个细胞 /mL，按荧光染色剂：细胞悬浮液1:500的比例在细胞悬浮液中加入Calcein-AM荧光染色剂。

所述步骤(3’)中的检测所设置的分选参数为：前向散射光(FSC)：330-400V，侧向散 射光(SSC)：220-260V，FITC通道：240-320V。

本发明采用的胶原酶Ⅰ属于蛋白水解酶，可以消化细胞间的结合物，便于细胞脱落，但 是如果浓度过大，或者消化时间过长，则会对细胞造成伤害，导致细胞裂解；通过实验摸索， 本研究认为1％的胶原酶有利于细胞的提取，但对细胞不造成伤害，但2％的胶原酶易造成细 胞裂解，见后面的步骤和数据，在胶原酶I溶液和培养基工作液中均加入双抗，能有效抑制 细菌生长，避免细胞污染。酶解后利用比重不同，通过密度梯度离心法提取、分离干细胞， 或者采用流式细胞仪分选，得到纯化的干细胞，本发明方法提取、分离得到的干细胞量大、 细胞形状规则且边缘清晰、没有任何破坏，可用于后续的功能研究。

本发明的有益效果是：采用本发明成功的对二化螟幼虫中肠干细胞进行了提取、分离及 鉴定，获得了二化螟中肠干细胞纯系，为后续的干细胞功能研究提供实验材料，为从免疫学 角度解析二化螟中肠干细胞的分化和增殖对Bt抗性的调控机制奠定基础。此外，本发明还为 其它鳞翅目昆虫中肠干细胞的研究提供借鉴。

附图说明

图1未用胶原酶Ⅰ消化而提取的二化螟幼虫中肠干细胞；

图2用0.2％胶原酶Ⅰ消化中肠，Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法提取、分离的二化螟 幼虫中肠干细胞；

图3用0.1％胶原酶Ⅰ消化后，提取的二化螟幼虫中肠细胞；

图4用0.1％胶原酶Ⅰ消化，Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法提取、分离的二化螟幼虫 中肠干细胞；

图5用0.1％胶原酶Ⅰ消化，Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法提取、分离的二化螟幼虫 中肠成肠细胞；

图6用0.1％胶原酶Ⅰ消化后，提取的二化螟幼虫中肠细胞流式分析图；

图7用0.1％胶原酶Ⅰ消化后，用流式细胞仪分选后的二化螟幼虫中肠干细胞流式分析图；

图8用0.1％胶原酶Ⅰ消化后，用流式细胞仪分选后的二化螟幼虫中肠成肠细胞流式分析图。

具体实施方式：

以下结合实例对本发明作进一步的说明：

细胞培养基工作液的配制(400ml)：

在无菌条件下操作，配制完成后，每管分装成40ml，标记好，于4℃保存备用。

胶原酶Ⅰ的配制

0.1％胶原酶Ⅰ

称取胶原酶Ⅰ(273IU/mg，Gibco公司)100mg，紫外灭菌20min后，在无菌条件下，用 PBS(pH7.4)溶解并定容至100mL，用0.45μm的一次性滤膜过滤后，加入100×的双抗， 加入的双抗在胶原酶Ⅰ溶液中的浓度为1％，再用0.22μm的滤膜过滤一次，然后分装，做好 标记，-20℃保存备用。

0.2％胶原酶Ⅰ

称取胶原酶Ⅰ100mg(273IU/mg，Gibco公司)，紫外灭菌20min后，在无菌条件下，用 PBS(pH7.4)溶解并定容至50ml，用0.45μm的一次性滤膜过滤，加入100×的双抗，加入的 双抗在胶原酶Ⅰ溶液中的浓度为1％，再用0.22μm的滤膜过滤一次，然后分装，做好标记， -20℃保存备用。

荧光染色剂Calcein-AM的配制

用50.2μL DMSO溶解100μg Calcein-AM(17783-100，Lot#BCBJ9045V)，Sigma公司 生产，配制2mM母液，使用前，用DMSO稀释至20μM。

Ficoll-Paque为Ficoll-Paque^TMPLUS，GE Healthcare公司生产，Label N 71-1017-00-E-I， 17-1440-02。

昆虫细胞培养液(Grace’s Insect Medium,TNM-FH,Catalog NO:04-501Q,LONZA公司生 产)，含10％的血清。

实施例1

未加胶原酶Ⅰ条件下，采用Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法对二化螟中肠干细胞进行 提取、分离和鉴定(以解剖20头二化螟3龄幼虫为例)；

1.1 无菌条件下，将二化螟3龄幼虫依次浸泡在2％的次氯酸钠溶液中2min、75％乙醇中2 min、无菌dd H₂O中2min，进行体表消毒；

1.2 将虫体置于用75％乙醇消毒过的蜡盘中，对二化螟幼虫中肠进行解剖，先用两根昆虫针 将幼虫的胸部和腹部末端固定在蜡盘上，再用剪刀在胸部和腹部末端分别剪一下，然后从腹 部剪口处沿着虫体剪向胸部剪口处，用镊子将中肠侧拉出来；

1.3 将中肠取出，放入盛有林格氏液的培养皿中，用眼科镊去除马氏管、围食膜和食物残渣 等；

1.4 将中肠剪成2mm左右的小段，放入10ml的离心管中，吸除上面的林格氏液，加入4ml 培养基工作液，27℃下孵育45min，并且每隔3min用手轻轻振荡离心管(便于细胞脱落)， 然后用移液枪上下抽吸、混匀，再依次过100目、200目细胞筛，最后在4℃和500g条件下， 离心5min，弃上清，收集沉淀的细胞；

1.5 重新用少量培养基悬浮细胞，在另一离心管中加入3ml Ficoll-Paque分离液，上面加1ml 细胞悬浮液(顺序不可颠倒)，4℃和600g条件下，离心15min；最上面约0.95ml处为干细 胞，标记为S，中间的舍去，最下面的0.25ml沉淀为成肠细胞，标记为M，然后向每个离 心管中分别加入4ml培养基，采用低速短暂离心(4℃和500g条件下，离心5min)的方法 分别清洗干细胞和成肠细胞，获得纯化的干细胞和成肠细胞，分别用1ml培养基工作液悬浮 干细胞和成肠细胞，获得各自的细胞悬浮液。

1.6 在倒置相差显微镜下分别观察分离前的中肠细胞和分离后的中肠干细胞和成肠细胞 (OLYMPUS IX83)，并用细胞计数器分别对其进行计数。

结果：没有加入胶原酶I，仅通过Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法提取并分离干细 胞，通过镜检，发现视野内有干细胞，但数量较少，进一步用细胞计数器进行计数，发现多 次提取所获得的干细胞悬浮液的干细胞密度大致为1.12-2.46×10³cell/mL(图1)，多次实验 干细胞提取量均不高。

实施例2

加入胶原酶Ⅰ，采用Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法对二化螟中肠干细胞进行提取、 分离和鉴定(以解剖40头二化螟3龄幼虫为例)；

2.1 无菌条件下，将二化螟3龄幼虫依次浸泡在2％的次氯酸钠溶液中2min、75％乙醇中5 min、无菌dd H₂O中2min，进行表面消毒；

2.2 将虫体置于用75％乙醇消毒过的蜡盘中，对二化螟幼虫中肠进行解剖，先用两根昆虫针 将幼虫的胸部和腹部末端固定在蜡盘上，再用剪刀在胸部和腹部末端分别剪一下，然后从腹 部剪口处沿着虫体剪向胸部剪口处，用镊子将中肠侧拉出来；

2.3 将中肠取出，放入盛有林格氏液的培养皿中，用眼科镊去除马氏管、围食膜和食物残渣 等；

2.4 将中肠剪成2mm左右的小段，分成等量的两份，分别放入10ml的离心管中，吸除上 面的林格氏液，一份加入2ml0.1％的胶原酶Ⅰ，另一份加入2ml0.2％的胶原酶Ⅰ，40℃水 浴条件下，消化40min，消化期间每隔3min摇一次离心管(便于中肠彻底消化)；

2.5 迅速加入4ml培养基工作液，依次过100目、200目细胞筛，4℃和500g条件下，离 心5min，弃上清，收集沉淀的细胞；

2.6 重新用少量培养基悬浮细胞，在另一离心管中加入3ml Ficoll-Paque分离液，上面加1ml 细胞悬浮液(顺序不可颠倒)，4℃和600g条件下，离心15min；最上面约0.95ml为干细胞， 标记为S，中间的舍去，最下面的0.25ml沉淀为成肠细胞，标记为M，然后向每个离心管 分别加入4ml培养基，采用低速短暂离心(4℃和500g条件下，离心5min)的方法分别清 洗干细胞和成肠细胞，获得纯化的干细胞和成肠细胞，分别用1ml培养基工作液悬浮干细胞 和成肠细胞，获得各自的细胞悬浮液；

2.7 在倒置相差显微镜下分别观察分离前的中肠细胞和分离后的中肠干细胞和成肠细胞 (OLYMPUS IX83)，并用细胞计数器分别对其进行计数。

结果：用0.2％的胶原酶Ⅰ消化中肠后，在倒置相差显微镜的视野下观察到的干细胞轮廓 不清晰、细胞边缘已损坏、形状不完整(图2)，多次试验所获得的干细胞悬浮液的干细胞密 度约为3.54-5.21×10⁵cell/mL。

用0.1％胶原酶Ⅰ消化中肠后，分离前在倒置相差显微镜下观察到细胞主要以成肠细胞 形式存在，包括呈高脚杯状的杯状细胞和呈圆柱形的柱状细胞(图3)，干细胞很少能见到； 在该条件下多次提取的二化螟幼虫中肠细胞密度约为1.24-2.68×10⁷cell/mL。用0.1％胶原酶 Ⅰ消化中肠后，通过Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法分离后，在倒置相差显微镜下观 察到中肠干细胞是一系列形状非常规则、细胞边缘非常清晰、呈球形的小型细胞，细胞直径 大约为5-18μm,且分离到的干细胞纯度较高(图4)；在该条件下，多次分离、提取的二化螟 幼虫中肠干细胞密度为1.37-2.75×10⁴cell/mL。用0.1％胶原酶Ⅰ消化中肠后，通过 Ficoll-Paque分离液和密度梯度离心法分离后，在倒置相差显微镜下观察到中肠成肠细胞是一 系列大型的、呈杯状或柱状的细胞，细胞边缘清晰，细胞形状规则，其细胞长径约为20-35μm， 短径约为10-15μm(图5)；在该条件下，多次分离、提取的二化螟幼虫中肠成肠细胞的密度 约为6.56-9.27×10⁶cell/mL。

上述结果说明，0.2％胶原酶Ⅰ浓度过大，对细胞造成了损伤；而采用0.1％的胶原酶Ⅰ 消化，既可以高效的提取细胞，又可保持其形状的完整性，分离过程中采用Ficoll-Paque分离 液和密度梯度差异离心法成功分离了二化螟中肠干细胞，其效果显著。

实施例3

加入胶原酶Ⅰ，采用流式细胞仪对二化螟中肠干细胞进行提取、分离和鉴定(以解剖20 头二化螟3龄幼虫为例)

由实施例2得知，0.1％的胶原酶Ⅰ有利于中肠干细胞的提取，且不损伤细胞，故在实施 例3中，加入0.1％的胶原酶Ⅰ对干细胞进行了提取。

3.1 无菌条件下，将二化螟3龄幼虫依次浸泡在2％的次氯酸钠溶液中2min、75％乙醇中5min、 无菌dd H₂O中2min，进行表面消毒；

3.2 将虫体置于用75％乙醇消毒过的蜡盘中，对二化螟幼虫中肠进行解剖，先用两根昆虫针 将幼虫的胸部和腹部末端固定在蜡盘上，再用剪刀在胸部和腹部末端分别剪一下，然后从腹 部剪口处沿着虫体剪向胸部剪口处，用镊子将中肠侧拉出来；

3.3 将中肠取出，放入盛有林格氏液的培养皿中，用眼科镊去除马氏管、围食膜和食物残渣 等；

3.4 将中肠剪成2mm左右的小段，放入10ml的离心管中，吸除上面的林格氏液，加入2ml 0.1％的胶原酶Ⅰ，40℃水浴条件下，消化40min，消化期间每隔3min摇一次离心管(便于 中肠彻底消化)；

3.5 迅速加入4ml培养基工作液，依次过100目、200目细胞筛，4℃和500g条件下，离心 5min，弃上清，收集沉淀的细胞；

3.6 加入适量培养基工作液将收集的细胞进行悬浮，并将细胞浓度调至2-5×10⁶cells/mL， 按照1:500(荧光染色剂：细胞悬浮液)的比例在细胞悬浮液中加入Calcein-AM荧光染色剂 (20μM)，避光，室温孵育20min，无菌条件下，用300目尼龙过滤网将细胞悬浮液过滤到 流式管中，然后用流式细胞仪(BD FACSAria SORPO)单色荧光进行分选和鉴定干细胞，分选 所设置的分选参数为：前向散射光(FSC)：350V；侧向散射光(SSC)：220V；FITC通道： 240V。

结果：未分选的二化螟幼虫中肠细胞分为两个细胞群，P3门为干细胞群，P4门为成肠细 胞群，其流式分析图见图6；分选后的二化螟幼虫中肠干细胞进入P3门，流式分析图见图7； 分选后的二化螟幼虫中肠成肠细胞进入P4门，其流式分析图见图8；分群明显，说明采用流 式细胞仪分选并鉴定二化螟幼虫中肠干细胞是可行的。