植物内生蜡样芽孢杆菌M22超氧化物歧化酶基因克隆及体外表达酶活性分析

摘要

超氧化物歧化酶(SOD)是一种金属酶.根据其活性位点结合的金属离子不同,SOD可分为CuZn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD以及最近发现的Ni-SOD.由于SOD可以使超氧阴离子自由基歧化生成过氧化氢和分子氧,从而在防止氧化胁迫方面发挥重要作用.又由于SOD有助于一些病原微生物拮抗寄主氧进发所产生氧自由基的杀伤作用,所以SOD被认为有助于一些胞内病原菌的侵入与定殖,是一种致病因子.蜡质芽孢杆菌M22菌株(Bacillus cereus M22)是该研究室从甜菜体内分离的、对多种植物病害具有良好防治效果的生防细菌.M22代谢液及胞内SOD含量较高,推测SOD可能在M22侵染宿主过程中以及在病害防治中发挥重要作用.该研究应用分子生物学技术克隆M22菌株中全部SOD基因,并在大肠杆菌(Escherichia coli)或毕赤酵母(Pichia pastoris)中对其进行了表达和功能的初步分析.主要研究结果如下:1蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达通过PCR技术,从蜡样芽孢杆菌M22基因组DNA中扩增到1317bp的基因序列,GenBank登录号为AY540749.2.蜡样芽孢杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及在E. coli中表达采用PCR技术,从蜡样芽孢杆菌M22基因组DNA扩增到长1320bp的基因片段.3.蜡样芽孢杆菌M22基因组文库的构建及铁超氧化物歧化酶基因片段的克隆以具有抗病、促生作用的植物内生蜡样芽孢杆菌M22为材料,制备其基因组总DNA,经限制性核酸内切酶Sau3AI部分酶切后,在T<,4>DNA连接酶作用下与经BamHI完全酶切、去磷酸化的粘粒pZL1连接后进行包装.4.蜡样芽孢杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的分泌表达根据已经克隆的蜡样芽孢杆菌CuZn-SOD的基因序列,设计特异引物,扩增CuZn-SOD的编码框序列.氧进发产生活性氧是多数植物拮抗病原微生物的机制之一,而微生物的SOD在防止活性氧对其杀伤中起重要作用.目前,我们对SOD在内生细菌侵染寄主过程中如何拮抗活性氧伤害的机理还一无所知.克隆SOD基因只是理解SOD在内生菌侵染过程作用的第一步,仍有很多工作亟待进一步深入研究

目录

文摘

英文文摘

第一篇文献综述

第一章生物体内的氧自由基及其清除系统

1自由基

2氧与自由基

3机体内氧自由基产生的主要部位

4机体内氧自由基的清除

第二章超氧化物歧化酶（SOD）的研究进展

1 SOD的分类

2 SOD的分布

3 SOD的分子进化

4 SOD基因的结构

5 SOD突变体及其在生物学研究中的作用

6大肠杆菌Mn-SOD基因表达的调控

7 SOD基因表达调控的分子机理

8 SOD在维持氧自由基平衡中的作用

9 SOD基因的克隆及表达

10 SOD基因工程的研究

11本研究的立论依据和研究意义

第二篇研究报告

第一章蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

1材料与方法

2结果与分析

3小结与讨论

第二章蜡样芽孢杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及在E.coli中表达

1材料与方法

2结果与分析

3小结和讨论

第三章蜡样芽孢杆菌M22基因组文库的构建及Fe-SOD基因片段的克隆

1材料与方法

2结果与分析

3小结与讨论

第四章蜡样芽孢杆菌M22铜锌超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

1材料与方法

2结果与分析

3小结与讨论

研究结论及进一步研究设想

参考文献

致谢

附录

附录A发表文章及克隆的基因序列

附录B缩略词表