不同日龄仔猪抗菌肽和乳铁蛋白基因表达的差异及断奶日龄对其基因表达影响的研究

摘要

本课题分别以1、14、28、42、56日龄仔猪和21日龄、28日龄、35日龄断奶仔猪为试验对象,以半定量RT-PCR法为检测手段,研究不同日龄仔猪抗菌肽PR-39、Protegrin-1和乳铁蛋白(Lactoferrin)基因表达的差异以及断奶日龄对仔猪抗菌肽PR-39、Protegrin-1和Lactoferrin基因表达的影响.根据已报道的猪PR-39、Protegrin-1、Lactoferrin和内标β-actin基因序列,设计抗菌肽(蛋白)和β-actin的引物,分别以骨髓和十二指肠mRNA为模板,经反转录和PCR,克隆得到了相应的抗菌肽PR-39、Protegrin-1,乳铁蛋白Lactoferrin以及内标β-actin的基因片断.对测序结果进行序列分析表明,得到的PR-39、Protegrin-1、Lactoferrin和β-actin基因的序列与Genebank登陆的相应基因片断(登录号分别为L23825、X79868、M81327和BC067141)同源性分别为100﹪、99﹪、99﹪和91﹪.以抗菌肽(蛋白)和内标β-actin基因的成功克隆为基础,本试验探讨了PCR体系中适宜的退火温度、MgCl<,2>浓度和循环次数,构建了适合于相应基因序列的优化半定量RT-PCR法,用于仔猪抗菌肽(蛋白)基因mRNA表达量的测定.

目录

致谢

英文缩写词

第一章前言

1.1抗菌肽(蛋白)的研究进展

1.1.1抗菌肽PR-39、Protegrin的研究进展

1.1.2乳铁蛋白的研究进展

1.1.3抗菌肽(蛋白)的研究应用前景

1.2断奶仔猪腹泻的原因及预防措施

1.2.1断奶仔猪腹泻发生的原因

1.2.2预防和治疗断奶仔猪腹泻的措施

1.3本研究的目的和意义

第二章仔猪骨髓抗菌肽(蛋白)基因和内标β-actin基因的克隆

2.1克隆策略

2.2试验材料

2.2.1动物材料

2.2.2菌种与载体

2.2.3试剂与工具酶

2.2.4引物

2.2.5培养基及主要化学试剂的配制

2.3试验方法

2.3.1基因组总RNA的提取

2.3.2反转录

2.3.3聚合酶链式反应(PCR)反应

2.3.4 PCR产物电泳及割胶回收

2.3.5 PCR收产物与pGEM-Teasy Vector连接

2.3.6感受态细胞的制备与目的DNA的转化

2.3.7重组克隆筛选和重组质粒的提取与鉴定

2.3.8重组DNA核苷酸序列测定分析

2.4试验结果

2.4.1抗菌肽(蛋白)和β-actin RT-PCR产物电泳结果

2.4.2质粒DNA PCR检验结果

2.4.3抗菌肽(蛋白)和β-actin测序结果

2.5讨论

第三章不同日龄仔猪抗菌肽和乳铁蛋白基因表达的差异

3.1试验材料

3.1.1动物材料

3.1.2试剂

3.2试验方法

3.2.1 RNA的提取

3.2.2反转录

3.2.3聚合酶链式反应(PCR)

3.2.4琼脂糖凝胶电泳

3.2.5半定量RT-PCR分析

3.3试验结果

3.3.1循环数对抗菌肽(蛋白)基因表达的影响

3.3.2 Mg2+浓度对抗菌肽(蛋白)基因表达的影响

3.3.3不同日龄抗菌肽(蛋白)基因表达的差异

3.4讨论

3.4.1 RT-PCR方法的构建

3.4.2不同日龄仔猪抗菌肽基因表达的差异

3.4.3不同日龄仔猪乳铁蛋白基因表达的差异

第四章断奶日龄对仔猪抗菌肽(蛋白)基因表达的影响

4.1试验材料

4.1.1动物材料

4.1.2试剂

4.2试验方法

4.3试验结果

4.3.1断奶日龄对抗菌肽PR-39基因表达的影响

4.3.2断奶日龄对抗菌肽Protegrin-1基因表达的影响

4.3.3断奶日龄对乳铁蛋白基因表达的影响

4.4讨论

小结

参考文献

附录一pGEM-Teasy Vector

附录二pGEM-3Z Vector