尸食性蝇类的分子鉴别及其发育生物化学特征用于死后间隔时间推断的基础研究

摘要

本文针对当前法医昆虫学中尸食性蝇类的幼期不易鉴别，以及可用于死后间隔时间推断的日龄指标较为缺乏之现状，就尸食性蝇类幼期种类的分子鉴别与其生长发育过程中蛋白质、糖类和脂类以及贮藏蛋白等生化特征的变化进行了系统测定，进而分析这些变化规律用于蝇类日龄推断的可行性，获得下列结果： 1.杭州地区常见尸食性蝇类的序列分析通过DNA的序列测定，对杭州地区常见的六种尸食性蝇类——巨尾阿丽蝇Aldrichinagrahami(Aldrich)、大头金蝇Chrysomya megacephala(Fabricius)、丝光绿蝇Lucilia sericata(Meigen)、棕尾别麻蝇Boettchereiscaperegrina(Robineau-Desvoidy)、肥须亚麻蝇Parasarcophagacrassipalpis(Macquart)、家蝇Musca domestica Linnaeus进行分子鉴定，在六个种类间成功的扩增到了mt DNA COⅡ基因的部分序列。DNA测序结果表明不同种类间的序列差异达到10％，而同一种类不同个体之间几乎没有差异，差异在1％以下。 2.双向凝胶电泳图谱用于常见尸食性蝇类初孵幼虫的鉴别双向电泳分析技术已在生物科学各领域被广泛应用，蛋白质组作图的意义已经日益显现。通过对四种常见尸食性蝇类大头金蝇Chrysomya megacephala(Fabricius)、棕尾别麻蝇Boettcheriscaperegrina(Robineau-Desvoidy)、肥须亚麻蝇Parasarcophaga crassipalpis(Macquart)和巨尾阿丽蝇Aldrichina grahami(Aldrich)初孵幼虫蛋白质组双向凝胶电泳和图象分析，发现各种类间双向电泳图谱差异显著，并对相应的等电点和相对分子量值进行聚类和判别分析，结果表明建立合适的尸食性蝇类初孵幼虫的双向电泳图谱有利于鉴别形态学极易混淆的昆虫种类。 3.巨尾阿丽蝇离食期幼虫肠道内容物的mt DNA检测以猪的mt DNA作为靶标，在幼虫体内成功的扩增到了肠道内容物的DNA，经序列比较与食源完全一致。研究结果表明，Cyt b基因不仅能在嗉囊中检测到也能从整个虫体中检测到，且前者的PCR产物比后者的PCR产物更明显。随着巨尾阿丽蝇幼虫消化时间的延长猪cyt b基因可检测到的概率随之下降。在这里可用改进的Logistic曲线方程表示巨尾阿丽蝇幼虫消化食物的时间与能检测到的概率关系模拟为：y=exp(a+b*x)/(1+exp(a+b*x))。(y表示可检测到的概率，x表示消化的时间，a、b两个常数)，并给出了不同温度下的模拟方程。 4.尸食性蝇类幼期蛋白质、脂类、糖含量和体重随发育变化的时间特征24℃下四种不同蝇类幼虫体重随着发育都在3日龄达到最大体重，之后随着日龄增加而逐渐降低。蝇类幼虫的体重变化可以用改进的Logistic曲线拟合其和日龄的关系。不同种类蝇类体重在蛹期呈不明显的下降趋势，其与日龄的关系可以线性关系拟合。24℃下四种不同蝇类幼虫蛋白质随着发育都在3日龄后变化不明显。蝇类幼虫的蛋白质含量变化可以用改进的Logistic曲线拟合其和日龄的关系。不同种类蝇类蛋白质含量在蛹期也呈逐渐下降趋势，其与日龄的关系可以线性关系拟合。24℃下不同蝇类幼虫总糖随着发育在4日龄后变化不明显。蝇类幼虫的总糖含量变化可以用改进的Logistic曲线拟合其和日龄的关系。不同种类蝇类总糖含量在蛹期也呈逐渐下降趋势，其与日龄的关系可以线性关系拟合。24℃下不同蝇类幼虫海藻糖随着发育呈现不同的变化趋势，达到最大值的日龄不尽相同。幼虫的海藻糖含量变化可以用改进的Logistic曲线拟合其和日龄的关系。不同种类蝇类海藻糖含量在蛹期也呈逐渐下降趋势，其与日龄的关系可以线性关系拟合。24℃下不同蝇类幼虫脂类含量随着发育在4日龄左右到达最大值。蝇类幼虫的脂类含量变化可以用改进的Logistic曲线拟合其和日龄的关系。不同种类蝇类脂类含量在蛹期也呈逐渐下降趋势，其与日龄的关系可以线性关系拟合。 5.温度对尸食性蝇类幼期可溶性蛋白、脂类和可溶性总糖以及体重变化的影响各温度下，幼虫体重在幼虫期初期随着日龄增加而显著增加，到达幼虫体重的最大值后，在此后各日龄中体重稍下降。但幼虫体重达到最大值的时间随着温度的降低而延长。用改进的Logistic曲线对不同种类不同温度下的体重与日龄关系进行拟合。体重在蛹初期显著下降，此后各日龄中体重稍下降，置蛹期末期下降加快。可用线性方程对不同种类不同温度下的体重与日龄关系进行拟合。各温度下，幼虫蛋白质含量在幼虫期初期随着日龄增加而显著增加，到达幼虫蛋白质含量的最大值后，在此后各日龄中蛋白质含量稍下降。但幼虫蛋白质含量达到最大值的时间随着温度的降低而延长。用改进的Logistic曲线对不同种类不同温度下的蛋白质含量与日龄关系进行拟合。各温度下，蛋白质含量在蛹期缓慢下降，可用线性方程对不同种类不同温度下的蛋白质含量与日龄关系进行拟合。各温度下，幼虫总糖含量在幼虫期初期随着日龄增加而显著增加，到达幼虫总糖含量的最大值后，在此后各日龄中总糖含量稍下降。另外，随着温度的升高，总糖含量的最大值也增加，而且幼虫总糖含量达到最大值的时间随着温度的升高而缩短。用改进的Logistic曲线对不同种类不同温度下的总糖含量与日龄关系进行拟合。各温度下，总糖含量在蛹初期显著下降，此后各日龄中总糖含量稍下降，到蛹期末期下降加快。用线性方程对不同种类不同温度下的总糖含量与日龄关系进行拟合。各温度下，幼虫脂类含量在幼虫期初期随着日龄增加而显著增加，到达幼虫脂类含量的最大值后，在此后各日龄中脂类含量稍下降。但幼虫脂类含量达到最大值的时间随着温度的降低而延长。用改进的Logistic曲线对不同种类不同温度下的脂类含量与日龄关系进行拟合。各温度下，脂类含量在蛹初期显著下降，此后各日龄中脂类含量稍下降，置蛹期末期下降加快。用线性方程对不同种类不同温度下的脂类含量与日龄关系进行拟合。 6.尸食性蝇类幼虫血淋巴可溶性蛋白组成的时间特征应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析了24℃下肥须亚麻蝇与丝光丽蝇幼虫和蛹期血淋巴可溶性蛋白组成的时间动态。结果表明：血淋巴中出现了多条清晰可见的蛋白带，其中在三龄幼虫不同日龄中，a、c、A、F和P带的含量差异较为显著，在各日龄蛹中，a、c、A、F和G带的含量有一定差异。这些蛋白带在幼虫或者蛹期各日龄间含量的差异具有应用于日龄推断的价值。 7.肥须亚麻蝇幼虫贮藏蛋白的纯化和多克隆抗体制备血淋巴经50～66％(NH4)2SO4提纯，经疏水层析后，后又经P-100凝胶层析对样品进行分子量分级分离，最后经阴离子交换层析得到纯的贮藏蛋白。已纯化蛋白为抗原，制备了贮藏蛋白的多克隆抗体，并纯化了抗血清。 8.ELISA检测两种麻蝇体内贮藏蛋白含量及温度的变化影响ELISA检测表明，各温度下，幼虫贮藏蛋白在幼虫期初期随着日龄增加而显著增加，到达幼虫最大值后，在此后各日龄中贮藏蛋白含量稍下降。但幼虫贮藏蛋白达到最大值的时间随着温度的降低而延长。可用改进的Logistic曲线对不同种类不同温度下的贮藏蛋白含量与日龄关系进行拟合。各温度下，幼虫贮藏蛋白含量在蛹初期稍上升至蛹期最大值，但温度越低所需时间越长。此后各日龄中贮藏蛋白含量稍下降，至蛹期末期下降加快。可用线性方程对不同种类不同温度下的贮藏蛋白含量与目龄关系进行拟合。自然温度下饲养的肥须亚麻蝇幼虫和蛹的贮藏蛋白含量检测后，发现幼虫期比蛹期更适合用来推断日龄。 9.结论就法医昆虫学而言，由于其是一门交叉学科，在相当程度上依赖于技术的进步。仅目前而言，笔者认为，现有的形态学指标和生化指标(包括本文的指标)如何进行综合运用满足现实的需求是当前最重要的。其他更精确的方法有待于其他新技术的成熟，如生物芯片对于昆虫鉴别，蛋白质芯片对于日龄推断的应用。

目录

前言

第一部分文献综述

第二部分试验研究

第一章杭州地区常见尸食性蝇类的分子鉴别

第二章双向凝胶电泳图谱用于常见尸食性蝇类初孵幼虫的鉴别

第三章巨尾阿丽蝇离食期幼虫肠道内容物的DNA检测

第四章四种尸食性蝇类幼期蛋白质、脂类、糖含量和体重随发育变化的时间特征

第五章温度对蝇类幼期蛋白质、脂类和总糖及体重变化的影响

第六章尸食性蝇类幼虫血淋巴可溶性蛋白组成的时间特征

第七章肥须亚麻蝇幼虫血淋巴贮藏蛋白的纯化

第八章贮藏蛋白抗体制备与ELISA检测最佳反应条件建立

第九章两种麻蝇体内贮藏蛋白含量及温度对其的影响

第十章总讨论

参考文献

附录 博士生期间发表和待发表文章

致谢