一种推断人体死后间隔时间的方法

摘要

本发明公开了一种推断人体死后间隔时间的方法，属于医学检验领域。所述方法包括：提取不同死亡时间的人的胆囊粘膜上皮细胞作为样本，并将所述样本涂片；将涂片后的所述样本进行染色；对染色后的样本进行图像分析，分析的参数包括：胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的异形指数、灰度参数和几何参数，灰度参数包括平均光密度、平均灰度和积分光密度；将参数进行统计，获得参数的线性回归方程，根据线性回归方程中的一个或多个确定死后间隔时间。本发明提供的推断人体死后间隔时间的方法，在人体死后5～36h内，通过分析胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的异形指数、灰度参数和几何参数，得到异形指数、灰度参数和几何参数与PMI关系，从而推断人体死后间隔时间。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种推断人体死后间隔时间的方法。

背景技术

人体死后间隔时间(postmortem interval，PMI)推断一直是法医病理学研究 的重点、难点和热点之一，尤其早期PMI的推断，在刑事侦查中排查犯罪嫌疑 人、仲裁死亡医疗纠纷等司法实践中更具现实意义。客观、准确的早期PMI推 断，可为公安机关刑事侦查提供重要的客观线索，有利于公安机关辨别犯罪嫌 疑人是否有作案时间，确定或缩小侦查范围，提高侦查效率和准确度。此外， 死后间隔时间的推断有时对自然灾害的评估分析、保险和财产继承也至关重要。

DNA是具有显著生化稳定性的遗传物质，同物种不同组织的体细胞的DNA 含量是恒定的。在机体死亡后，细胞组织发生缺血、缺氧，随着氧自由基生成 增多，细胞自身消化，其结构进行解体，DNA也逐渐发生降解，其DNA的含 量及细胞核的形态变化亦具规律性，表现为核凝固、边集、碎裂、溶解等改变。 研究人员在研究死后间隔时间时，其研究对象均为脑细胞、脾细胞或肝细胞， 且研究人员均认为仅在脑细胞、脾细胞或肝细胞中的DNA能够准确反映死后间 隔时间。

发明内容

为了解决现有技术中没有针对胆囊反映死后间隔时间的问题，本发明实施 例提供了一种推断人体死后间隔时间的方法。所述技术方案如下：

本发明提供了一种推断人体死后间隔时间的方法，所述方法包括：

提取不同死亡时间的人的胆囊粘膜上皮细胞作为样本，并将所述样本涂片；

将涂片后的所述样本进行染色；

对染色后的所述样本进行图像分析，所述分析的参数包括：所述胆囊粘膜 上皮细胞的细胞核的异形指数、灰度参数和几何参数，所述灰度参数包括平均 光密度、平均灰度和积分光密度；

将所述参数进行统计，获得所述参数的线性回归方程，所述线性回归方程 为：

Y_ID＝11.333X_ID-33.338，其中，Y_ID为推断的死后间隔时间，X_ID为对应测 量的异形指数；

Y_AG＝0.679X_AG-54.277，其中，Y_AG为推断的死后间隔时间，X_AG为对应测 量的平均灰度；

Y_AOD＝-178.868X_AOD+84.222，其中，Y_AOD为推断的死后间隔时间，X_AOD对应测量的平均光密度；

Y_IOD＝-6.422X_IOD+91.398，其中，Y_IOD为推断的死后间隔时间，X_IOD为对 应测量的积分光密度；

根据所述线性回归方程中的一个或多个确定死后间隔时间。

具体地，所述样本剪取自所述人死后5～36h的所述胆囊粘膜上皮细胞。

进一步地，所述涂片的方法为：将取出的所述样本置于含有400mg/L的庆 大霉素的生理盐水中，首次剪取所述样本的时间在所述人死后5h完成，在18℃ 恒温箱中存放0.5h，然后在保湿盒内，剪取0.5cm×0.5cm×1cm所述样本1 份，且每隔1h剪取一次，将剪取的所述样本浸于清水中洗涤，取出所述样本并 用滤纸吸干，将吸干后的所述样本涂布。

进一步地，将涂布后的所述样本采用孚尔根染色方法进行染色。

具体地，所述孚尔根染色方法包括：将备染的所述涂片浸入固定液中固定 0.5h，取出后置于6N盐酸溶液中水解30min，取出后置于蒸馏水中洗涤，再 浸入由副品红配制的席夫氏试剂中放置30min，用浓度为0.5％的偏重亚硫酸钠 溶液浸洗2min，重复浸洗三次，流水冲洗5min后，进行封片。

进一步地，所述固定液为卡诺氏固定液。

具体地，所述图像分析采用彩色病理图像分析系统。

进一步地，在显微镜高倍物镜下摄取染色后的所述涂片的图像视野，以“弓” 字型的形状作为采集线路，保证采集的图像无重复、无交叉，且每张所述涂片 随机取10个视野，每个视野采集一幅图像。

进一步地，所述几何参数包括面积、平均直径、等效直径和周长。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供的推断人体 死后间隔时间的方法，通过分析胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的异形指数、灰度 参数和几何参数，得到异形指数、灰度参数和几何参数与PMI关系，从而推断 人体死后间隔时间，此外，相比较于其他组织细胞，胆囊粘膜上皮细胞的细胞 核易于提取和保存，样本的处理比较简便避免了个体差异及外界因素的影响， 克服一定的主观性、经验性，保证了死亡时间推断的准确性、可靠性和可重复 性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核面积随PMI的变化 图；

图2是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的平均直径随PMI 的变化图；

图3是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的等效直径随PMI 的变化图；

图4是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的周长随PMI的变 化图。

图5是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的异形指数随PMI 的变化图

图6是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的平均灰度随PMI 的变化图；

图7是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的平均光密度随 PMI的变化图；

图8是本发明实施例提供的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的积分光密度随 PMI的变化图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 实施方式作进一步地详细描述。

胆囊位于右方肋骨下肝脏后方的梨形囊袋构造，有浓缩和储存胆汁之作用。 胆囊分底、体、颈、管四部，颈部连胆囊管。胆囊壁由粘膜、肌层和外膜三层 组成。该粘膜具有典型的吸收型细胞的特征，具有较强的吸收和浓缩功能，该 粘膜亦有分泌粘液的功能，在粘膜中，除了一般的细胞外，还有内分泌细胞。 发明人在实现本发明的过程中，发现胆囊这一器官也可用于推断人体死后间隔 时间。下面采用结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

选择湖北地区2013年具有确切死亡时间的离体人的胆囊组织30例，死者 年龄以30±10岁居多，其中，男性28例(占总数的93.33％)，女性2例(占总 数的6.67％)。取材前的尸体保存于16～25℃的环境中，取材的实验环境温度在 14.5～25℃，首次取材时间均在人体死后5h完成。

在无菌手术条件下取出完整的胆囊，并置于含400mg/L庆大霉素的生理盐 水中，在18℃恒温箱中存放0.5h，然后在无菌洁净的保湿盒内，剪取0.5cm× 0.5cm×1cm样本1份，且每隔1h剪取一次，将剪取的样本浸入清水中摆动洗 涤，清洗血浆成份及血细胞，取出该样本并用滤纸吸干，用镊子夹住吸干后的 样本进行涂片，并按照均匀的直线涂布方式进行涂布。本发明在样本制备过程 中，无须破坏胆囊粘膜上皮细胞的形态结构，也不用制作胆囊组织的单细胞匀 浆悬液。

涂片由专人统一测量分析，每次采集前均设置相同的系统环境，图像分析 仪每次重新开启后、进行测量前，均要进行尺度定标、光密度定标。所有操作 程序的步骤、次序一致。

其中，胆囊内面由粘膜、肌层和外膜三层组成，组成成分除了粘膜细胞和 内分泌细胞外，还包括胞质内线粒体、粗面内质网、粘液颗粒、血管、淋巴管 和神经等，胆囊在采集及样本小块分割过程中，都会不同程度的被细菌或者微 生物污染，有些成分本身就携带有微生物或细菌，所以其中任何一部分被污染， 都会影响周围的其他成分，本发明将取出完整的胆囊置于400mg/L庆大霉素的 生理盐水中，这样可以较彻底的祛除样本表面的细菌等可能干扰实验结果的物 质，同时又不会破坏细胞内部结构，不影响细胞提取和涂片效果。

胆囊粘膜上皮细胞胞质嗜酸性，且吸收胆汁中的水和无机盐(主要是Na+)， 置于在18℃恒温箱中存放0.5h，一方面可以保证细胞酸碱度和电解质的平衡， 使细胞不会发生酸碱失衡；另一方面可以保证样本的新鲜度，使细胞表面及内 部湿润，不发生较严重的脱水现象，最大程度的保证样本细胞的完整性。

按照上述操作方法，样本消毒较彻底，细胞提取过程顺利，细胞结构完整， 提取效果良好，涂片效果达到实验设定的要求，保证了实验结果的客观性、科 学性和准确性。

样本涂片后，采用孚尔根(Feulgen-Vans)染色方法显示胆囊粘膜上皮细胞 的细胞核，以用于细胞核DNA的定量测量。

采用孚尔根染色方法的具体步骤如下：

将备染的涂片浸入卡诺氏(Carnoy)固定液固定0.5h，取出后置于6N盐 酸溶液中水解30min，取出后置于蒸馏水中洗涤，再浸入由副品红配制的席夫 氏(Schiff)试剂中放置30min，用浓度为0.5％的偏重亚硫酸钠溶液浸洗2min， 重复浸洗三次，流水冲洗5min后，用常规中性胶(例如中性树脂)进行封片， 每个胆囊组织在死后5～36h内的所有涂片，均来自同一个个体，须一次性集中 完成染色。

胆囊粘膜上皮细胞首次涂片时间最早在死亡后3～5h，因此，本发明选择 的有效数据统一从第5h起，由本发明的前期动物实验研究表明，0～6h内DNA 降解几乎呈平台现象。同时，由于在本发明的实验环境下，死亡36h后人胆囊 组织自溶严重而较难被薄层涂片，故研究时间选择在死后36h内完成。

其中，Carnoy固定液的配制按照体积比为无水酒精：三氯甲烷：冰醋酸＝ 6:3:1。

采用Motic Med6.0CMIAS彩色病理图像分析系统(北京麦克奥迪图像技术 有限公司提供)，在显微镜高倍物镜(400×)下摄取染色后的涂片的图像视野， 以“弓”字型的形状作为采集线路，保证采集的图像无重复、无交叉，每张涂 片随机取10个视野，每个视野采集一幅图像。

具体地，在保证符合统计学的前提下，要求尽量增大样本量。在符合统计 学计量资料显著性检验结果的前提下，本发明至少需要11例个体样本资料才能 反应总体的情况，同时需将每张涂片分成9个视野、并随机取6个视野、每帧 图像(每个视野随机采一帧图像)随机取10个细胞，即可满足对总体推论的需 要。

分析的参数包括：胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的异形指数(Index of density， ID)、灰度参数和几何参数，其中，灰度参数包括：平均光密度(Average Optical  Density，AOD)、平均灰度(Average Gray，AG)和积分光密度(Integral Optical  Density，IOD)；几何参数包括：面积(Area，A)、平均直径(Average Diameter， AD)、周长(Perimeter，P)和等效直径(Equivalent Diameter，ED)

对上述参数进行测量，再分别选择体视分析系统和DNA分析系统进行自动 测量，获得对应的相关数据。

数据采用SPSS10.0统计软件进行相关性和线性回归分析，具体如下：

胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的几何参数

用于统计的每个最终几何参数值均为同一PMI的时间点中30例样本的所有 被检测细胞某一参数的均值。

表1  不同PMI胆囊粘膜上皮细胞的细胞核各几何参数测量的均值

实验结果：由表1中的参数可知，几何参数与死后间隔时间无统计学相关 性。

将几何参数进行统计，获得几何参数与死后间隔时间无统计学的相关性。

胆囊粘膜上皮细胞的细胞核面积，在人体死后5～15h呈明显上升趋势，在 18～30h呈一平台波动，在30～36h呈下降趋势，参见图1，而在死后5～36h 内其变化与对应的PMI无统计学相关性。

胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的平均直径的测量值在成熟淋巴细胞的正常大 小(6～8μm)范围上下波动，参见图2，其在死后5～36h内与对应的PMI无 统计学相关性。

胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的等效直径，在人体死后5～15h呈明显上升趋 势，18～30h呈一平台，30～36h呈下降趋势，参见图3，其等效直径整体变化 趋势与面积参数类似，在死后5～36h内其变化与对应的PMI无统计学相关性。

胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的周长，在死后5～36h内与对应PMI无统计 学相关性，其周长的均值在29μm上下波动，参见图4。

胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的异形指数

人体死后5～36h内，人体的胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的异形指数(ID) 随PMI的延长而呈上升趋势，参见图5。具体统计的对应相关系数平方、校正 相关系数平方、标准误、线性回归方程及其配合适度检验结果见表2和表3。结 果表明：异形指数与PMI之间有很强的统计学相关性，并存在线性关系。

表2  异形指数与PMI的相关性分析

表3  异形指数与PMI的线性回归分析

由表2和表3可知，异形指数与PMI之间有很强的统计学相关性，且R²为0.967，R²为判定系数，异形指数与PMI的线性关系，经方差检验有统计学 意义(p<0.01，p值为结果可信程度的一个递减指标)，表明该异形指数对PMI 具有回归贡献，即该异形指数与PMI存在明确的数量依存关系。其中，线性回 归方程为Y_ID＝11.333X_ID-33.338(Y_ID为推断的PMI；X_ID为对应PMI测量的 ID均值)，其回归方程中的偏回归系数，经统计学无效假设检验(T test)显示： 在ɑ＝0.01水平上拒绝无效假设(P<0.001)，说明异形指数与PMI之间存在线 性关系。

胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的灰度参数

用于统计的每个最终灰度参数值均为同一PMI的时间点中30例样本的所有 被检测细胞某一参数的均值。

表4  不同PMI胆囊粘膜上皮细胞的细胞核各灰度参数测量均值

Motic Med6.0CMIAS彩色病理图像分析系统只要求精确到小数点后一位 数，使得AG值近保留小数点后一位。

人体死后5～36h内，胆囊粘膜上皮细胞的细胞核的平均灰度随PMI延长 而呈上升趋势，参见图6。统计的对应相关系数平方、校正相关系数平方、标准 误、线性回归方程及其配合适度检验结果见表5和表6。

表6  平均灰度与PMI的相关性分析

表7  平均灰度与PMI的线性回归分析

由表5和表6可知，平均灰度与PMI之间有很强的统计学相关性(R²为 0.921)，平均灰度与PMI的线性关系，经方差检验有统计学意义(p<0.01)，表 明该平均灰度对PMI具有回归贡献，即该参数与PMI存在明确的数量依存关系， 参见表7。得出的线性回归方程为：Y_AG＝0.679X _AG–54.277(Y_AG为推断的PMI； X _AG为平均灰度对应PMI测量的AG均值)，该回归方程的偏回归系数，经统计 学无效假设检验(T test)显示：在ɑ＝0.01水平上拒绝无效假设(P<0.001)， 说明平均灰度与PMI之间存在线性关系。

人体死后5～36h内，胆囊粘膜上皮细胞核的平均光密度的随PMI延长而 呈下降趋势，参见图7，统计的对应相关系数平方、校正相关系数平方、标准误、 线性回归方程及其配合适度检验结果见表7、表8。

表7平均光密度与PMI的相关性分析

表8平均光密度与PMI的线性回归分析

由表7和表8可知，平均光密度与PMI之间有很强的统计学相关性(R²为 0.921)。平均光密度与PMI的线性关系，经方差检验有统计学意义(p<0.01)， 表明该参数对PMI具有回归贡献，即该参数与PMI存在明确的数量依存关系， 参见表7。得出的线性回归方程为：Y_AOD＝-178.868X _AOD+84.222(Y_AOD为推断 的PMI；X _AOD为平均光密度对应PMI测量的平均光密度均值)，其回归方程中 的偏回归系数，经统计学无效假设检验(T test)显示：在ɑ＝0.01水平上拒绝 无效假设(P<0.001)，说明平均光密度与PMI之间存在线性关系。

人体死后5～36h内，胆囊粘膜上皮细胞核的积分光密度随PMI的延长而 呈下降趋势，参见图8，具体统计的对应相关系数平方、校正相关系数平方、标 准误、线性回归方程及其配合适度检验结果见表9、表10。

表9  积分光密度与PMI的相关性分析

表10积分光密度与PMI的线性回归分析

由表7和表8可知，积分光密度与PMI之间有很强的统计学相关性(R²为 0.892)。积分光密度与PMI的线性关系，经方差检验有统计学意义(p<0.001)， 表明该参数对PMI具有回归贡献，即该积分光密度与PMI存在明确的数量依存 关系，参见表9。线性回归方程为Y_IOD＝-6.422X_IOD+91.398(Y_IOD为推断的PMI； X_IOD为积分光密度对应PMI测量的IOD均值)，其回归方程的偏回归系数经统 计学无效假设检验(T test)显示：在ɑ＝0.01水平上拒绝无效假设(P<0.001)， 说明积分光密度与PMI之间存在线性关系。

根据线性回归方程中的一个或多个确定死后间隔时间，具体地，在通过线 性回归方程得到推断的死后间隔时间时，可以采用一个线性回归方程，也可以 采用多个线性回归方程，若所得的多个推断的死后间隔时间不一致时，则取多 个推断的死后间隔时间的平均值，该平均值为推断的死后间隔时间。

本发明提供的推断人体死后间隔时间的方法，在样本的种类的选择方面， 本发明以人的胆囊粘膜上皮细胞为首选研究对象，胆囊组成细胞主要是粘膜上 皮细胞，组织来源相对单一，其相应的细胞间差异及干扰较小，且相对于其它 脏器而言，其病理病变极少。同时本发明的前期动物实验亦证实，胆囊是图像 分析最好的被选器官之一。在人体死后5～36h内，通过分析胆囊粘膜上皮细胞 的细胞核的异形指数、灰度参数和几何参数，得到异形指数、灰度参数和几何 参数与PMI关系，从而推断人体死后间隔时间，此外，相比较于其他组织细胞， 胆囊粘膜上皮细胞的细胞核易于提取和保存，样本的处理比较简便避免了个体 差异及外界因素的影响，克服一定的主观性、经验性，保证了死亡时间推断的 准确性、可靠性和可重复性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。