遗传毒物苯并芘/非遗传毒物诱导γH2AX焦点形成能力的研究

摘要

日前，与环境致癌物相关的肿瘤发病率呈上升趋势，准确地检测环境中的致癌物是预防和治疗癌症的重要任务之一。致癌物包括遗传毒物和非遗传毒物。遗传毒物通过损伤遗传物质DNA而起细胞毒作用。非遗传毒物包括一些细胞毒素、免疫抑制剂等等，它们不通过与DNA作用而促进癌症的发生。迄今所知的大多数致癌物都是遗传毒物，它们对DNA的损伤包括DNA单链断裂(DNAsinglestrandbreaks，SSBs)、双链断裂(DNAdoublestrandbreaks，DSBs)、DNA加合物形成、链内/链间交联及碱基置换等等，其中DSBs被认为是最严重的损伤方式之一。因此，如何准确对DSBs的检测有助于癌症的预防和治疗。 近年来研究发现，DSBs出现后，组蛋白家族成员H2AXC-端139位丝氨酸残基(Ser)可被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)样家族成员磷酸化形成γH2AX(gamma-H2AX)。γH2AX可以募集其它DNA修复蛋白到损伤位点，形成焦点(foci)结构，共同完成DNA修复过程。在电离辐射(IR)后，在损伤位点快速形成γH2AX焦点，并且焦点的数量与IR造成的DSBs的数量存在一一对应关系，表明γH2AX焦点的形成可用于检测IR诱导的DSBs。另外发现，其它间接导致DSBs的遗传毒物如顺铂、喜树碱也诱导γH2AX焦点的形成。因此，直接或者间接导致的DSBs的产生都能诱导γH2AX焦点的形成。γH2AX焦点与DSBs之间的密切关系表明γH2AX极有可能成为检测细胞DNA损伤特别是DSBs的一个新的特异性指标。 苯并(a)芘(B(a)P)是典型的强致癌性的多环芳烃类化合物，是一种间接遗传毒物，进入体内需经过细胞色素P450家族代谢活化才呈现强致癌作用。其终代谢产物二氢二醇环氧苯并芘(BPDE)可以与DNA共价结合，最终导致细胞生长分化功能失调而癌变。 咪唑硫嘌啉(Aza)、环孢素霉A(CsA)是临床上常用的免疫抑制剂，主要用于移植后的排斥反应。它们可以促进细胞的坏死，对细胞的损伤不通过遗传物质DNA，是非遗传毒物质。 由于γH2AX极有可能成为检测细胞DNA损伤特别是DSBs的一个新的特异性指标，我们选择了一系列的物理/化学因素作用于人羊膜上皮FL细胞，研究细胞在不同处理因素作用下γH2AX焦点的形成情况。本研究基于这个基础上，研究间接遗传毒物B(a)P，非遗传毒物Aza/CsA损伤细胞后γH2AX焦点形成情况。 我们用MTT比色法观察了各种浓度的B(a)P(0.01，0.1，1，10，20，50，100μM)及Aza(20μg/ml)、CsA(20μg/m)对FL细胞的毒性作用，发现各浓度的B(a)P对FL细胞生存率没有明显影响，20μg/ml的Aza和CsA则具有明显的细胞毒作用。 通过免疫荧光实验发现，在各浓度的B(a)P(0.1，1，10，50μM)处理细胞10min、2h，没有明显诱导γH2AX焦点形成。8h、24h时，则有明显诱导了γH2AX焦点的形成，并且有明显的时间、剂量依赖效应，最高浓度50μM作用后，焦点形成最多、最强。24h时甚至也比8h时候有更多的细胞中含有γH2AX焦点。我们还发现，在50μMB(a)P作用后，有大量的微核(micronuclei)形成。而20μg/mlAza/CsA作用FL细胞后检测γH2AX焦点，发现与对照相比，γH2AX焦点数量没有显著变化。 通过中性彗星实验发现B(a)P能诱导细胞DSBs，而Aza/CsA不能诱导DSBs。 结论：1.间接遗传毒物B(a)P能诱导γH2AX焦点的形成，并且有时间剂量依赖效应。 2.非遗传毒物Aza/CsA不能诱导γH2AX焦点形成。 3.γH2AX焦点形成与DSBs之间有着密切关系，可以用来准确地检测DSBs的发生。

目录

缩略语

前言

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

NBS1在DNA损伤修复中的功能

致谢