16S rRNA基因荧光定量PCR-基因芯片杂交法的建立及其应用研究

摘要

新生儿败血症(neonatalsepsis)发病隐匿，临床症状无特异性，存活者有相当一部分发生后遗症。因此，寻找快速、敏感而特异的新生儿败血症早期诊断指标，对指导临床治疗、降低新生儿死亡率、改善预后，具有十分重要的意义。在本研究中，分析细菌16SrRNA基因序列，在其保守区设计引物和探针，进行荧光定量PCR与基因芯片杂交分析，最终建立了细菌16SrRNA基因荧光定量PCR与基因芯片杂交相结合的方法快速检测细菌DNA，并对临床标本进行检测取得良好效果。本研究分二部分： 第一部分16SrRNA基因荧光定量PCR—基因芯片杂交技术的建立方法： 在细菌的16SrRNA基因保守区域设计通用引物，并在该引物的扩增的区域内设定一条通用荧光探针。对阳性标准菌株组、阴性对照组进行荧光定量PCR检测、分析。同时在细菌16rRNA基因保守区设计引物，设置区分革兰氏阴性菌、阳性菌与其他特异性菌属的探针，制成基因芯片，通过对标准菌株、阴性对照组进行芯片荧光杂交、洗脱、扫描，最后进行分析。 结论:FQ-PCR检测灵敏度高；耗时少；不受标本中存在抗菌药物或其他抑菌物质的干扰；定量分析准确，有助于评价治疗效果、判断预后，有效解决了PCR污染问题。基因芯片其杂交敏感性高，能检出特殊培养，难以培养等细菌；可检测任何无菌体液，如血、脑脊液、胸水等；最快4小时检测，具有高通量性，多种项目可一次检测。此项复合方法可为细菌感染的早期、快速诊断提供新的有效手段。 第二部分16SrRNA基因荧光定量PCR—基因芯片杂交技术的临床应用研究方法： 本院新生儿、重症监护室(ICU)、15病区综合病房临床拟诊为化脓性脑膜炎的住院患儿标本49例，每例均抽取脑脊液2ml，其中1ml作脑脊液细菌培养，1ml作细菌DNAFQ-PCR测定及芯片杂交。同时对临床疑为败血症的住院患儿830例标本，每例抽取静脉血各1ml分别行血培养和细菌16SrRNA基因FQ-PCR—基因芯片杂交检测。 结论：荧光定量PCR阳性的标本其基因芯片杂交结果与血液培养结果基本一致，从而进一步证实了这项诊断技术具有较高的特异性和准确性。荧光定量PCR与基因芯片杂交技术二者的阳性检出率均高于常规血培养法，说明该项技术较血培养敏感性高，能减少对败血症的漏诊。通过细菌荧光定量PCR法可以迅速对新生儿败血症的致病原菌有一个初步的筛查，减少阳性标本的疏漏，进一步芯片杂交以确定并区分细菌的类型，从而为败血症和化脑的病原学早期诊断提供了有效的手段。

目录

前言

第一部分 16S rRNA基因荧光定量PCR-基因芯片杂交技术的建立

第二部分 16S rRNA基因荧光定量PCR-基因芯片杂交技术的临床应用研究

参考文献

综述 16S rRNA基因在临床上的应用进展

附录：在读期间发表的论文及在读期间参加的学术会议

致谢