过氧化氢、Aβ（1-42）和Tau蛋白对两原代培养星形胶质细胞的效应对比研究

摘要

脑老化是人们在享受长寿时不可避免的事件.大量的报道指出,随着年龄的增加,大脑内的神经元数量逐渐减少,而神经胶质细胞的数量和体积逐渐增加,这可能是脑老化的基础.衰老是引起很多疾病的诱因,阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)就是最常见的一种衰老相关的疾病.目前已经证实,β淀粉样蛋白沉积在细胞外形成的老年斑和过磷酸化的tau蛋白在细胞内形成的神经纤维缠结是AD最主要的病理学特征. β-淀粉样蛋白在衰老的星形胶质细胞的研究很少,也无tau蛋白对体外培养的星形胶质细胞的研究报道.本实验我们首先建立了两分别来自SAM R1和P8新生小鼠大脑皮质的原代培养星形胶质细胞,模拟衰老过程中的星形胶质细胞.继而以这两细胞作为实验对象,研究了不同浓度的过氧化氢、Aβ1-42和tau蛋白对不同分化成熟的星形胶质细胞的作用,探讨星形胶质细胞在衰老过程中的功能变化. 第一部分 星形胶质细胞的建立及细胞增殖能力检测 目的:建立两分别来自衰老倾向小鼠SAM P8和R1新生鼠大脑皮质星形胶质细胞,并检测两细胞的增殖能力. 方法: (1)采用原代培养方法从新生(1-3天)SAMP8和R1小鼠大脑皮质区获得星形胶质细胞,接种于无菌细胞培养瓶,于37℃5﹪CO<,2>孵箱培养并观察细胞的生长状况.于第7-8天在200rmp/min转速下振摇纯化细胞8h,弃去悬浮细胞并换新的培养基继续培养,直至进行下一步实验; (2)采用免疫细胞化学检测GFAP蛋白在星形胶质细胞中的表达,并检测获得的两星形胶质细胞的纯度; (3):MTT还原实验检测两细胞的增殖能力. 结论:首次原代培养了两来自具有不同衰老程度的小鼠(SAMR1和P8)新生鼠大脑皮质星形胶质细胞.SAMR1和P8新生鼠大脑皮质星形胶质细胞在体外培养时可能具有不同的增殖能力. 第二部分 过氧化氢对两星形胶质细胞的作用 目的:研究并比较不同浓度的过氧化氢(H<,2>O<,2>)对两星形胶质细胞(SAM P8和R1)的作用. 方法:不同浓度的过氧化氢(H<,2>O<,2>)(0,100,200,400 μ M)分别处理两细胞1小时或4小时后,扫描电子显微镜(SEM)观察过氧化氢对两星形胶质细胞的形态学影响;MTT实验检测两细胞还原能力;碘化丙啶染色荧光镜下检测细胞存活;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(TUNEL)的染色方法原位检测细胞凋亡;免疫组织化学检测细胞乳酸脱氢酶活性; Western blot检测过氧化氢对星形胶质细胞胶质纤维酸蛋白(GFAP)、超氧化物歧化酶(SOD)及凋亡相关蛋白caspase-3和Bax的表达水平. 结论:两分别来自SAM P8和R1新生小鼠大脑皮质区的星形胶质细胞用过氧化氢处理后,两细胞死亡率具有显著性差异.在损伤后,两细胞具有相同的形态学改变如微绒毛和侧突丢失.高浓度过氧化氢(400μM)短时间处理细胞(1小时)能增加细胞的合成;而较高浓度过氧化氢(200μM)长时间处理细胞(4小时)能降低细胞内合成,引起微管聚合.过氧化氢处理后两细胞可以有相似的效应:MTT还原能力和胶质纤维酸蛋白表达下降,碘化丙啶检测细胞死亡增加,TUNEL染色方法原位检测细胞凋亡增加,超氧化物歧化酶、切冬酶-3和Bax表达上调.过氧化氢400μM处理时,P8细胞和R1细胞反应具有显著性差异(p<0.05),表明P8和R1两细胞在对抗氧化应急时可能有不同的后果,并提示在高浓度过氧化氢刺激时能明显减弱P8星形胶质细胞对神经元丢失的保护作用,目前机制尚不清.老化程度不同的星形胶质细胞对过氧化物解毒能力改变在中枢神经系统衰老和衰老相关的发病过程,可能有重要的作用. 第三部分 Aβ(1-42)和Tau蛋白对两星形胶质细胞的作用 目的:探讨并比较 A β(1-42)和 tau 蛋白单独或联合处理对两星形胶质细胞的作用. 方法:用不同浓度的 Aβ(1-42) (1μM和5μM)、tau蛋白(100nM)及两者物质的混合物Aβ(1-42)1μM/5μM+tau 蛋白(100nM)及不含Aβ和tau蛋白的DMEM/F-12无血清培养基(对照组),分别处理两星形胶质细胞(SAM P8和R1)24小后,用免疫细胞化学分别检测蛋白激酶 C (cPKC)、己糖激酶(Hexokinase)、乳酸脱氢酶(LDH)、Aβ前体蛋白(APP)、NMDA受体、GFAP在两细胞的表达,用 Western blot 分别检测GFAP、乳酸脱氢酶(LDH)、切冬酶.3(caspase-3)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、己糖激酶(Hexokinase,HXK)、蛋白激酶 C (cPKC)、A β前体蛋白(APP)、S100β蛋白分别在两细胞中的表达.应用激光共聚焦显微镜观察 Aβ(1-42)和 tau 蛋白处理后两细胞GFAP蛋白和微管蛋白 (Tubulin) 的共表达. 结论:首次应用Aβ(1-42)和tau蛋白对两不同分化成度的细胞(SAMR1和P8)比较研究,发现Aβ(1-42)与tau蛋白对两细胞(SAM R1和P8)的cPKC、HXK、LDH、APP、NMDA receptor、Caspase-3、S100β和GFAP等表达能产生影响,并且在两细胞可产生不同后果,为研究衰老过程中星形胶质细胞的功能改变提供了依据.

目录

缩略语表

前言

第一部分 星形胶质细胞的建立及细胞增殖能力检测

前言

一、实验材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第一部分 附图

第二部分 过氧化氢对两星形胶质细胞的作用

前言

一、实研材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 附图

第三部分 Aβ(1-42)和Tau蛋白对两星形胶质细胞的作用

前言

一、实验材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 附图

结 论

参考文献

β-淀粉样蛋白在阿尔茨海默氏病中的作用及其治疗措施

待发表文章

附录

致谢