白藜芦醇对过氧化氢诱导的原代脊髓星形胶质细胞毒性的保护作用

摘要

神经系统变性疾病以阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和帕金森病（Parkinson disease，PD）为代表，其病因学和发病机制尚不清楚，而临床上又无有效控制病程进展的措施，找到一关键的治疗靶点和有效药物极为重要。
　　 星形胶质细胞（astrocytes）在多种神经变性疾病的发病机制中起关键性作用。星形胶质细胞的反应性增生是共同的病理特点。正常情况下星形胶质细胞释放营养因子和清除突触间隙的谷氨酸，支持和保护运动神经元，星形胶质细胞活化后，其形态功能改变，以及它与运动神经元的相互作用发生紊乱，导致了运动神经元的死亡，加速疾病进展。星形胶质细胞是神经变性疾病的重要治疗靶点。
　　 机体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和清除失去平衡，导致ROS在体内大量蓄积，产生氧化应激。当谷氨酸转运体失表达或反向释放谷氨酸时，引起突触间隙或胞外谷氨酸大量蓄积从而导致神经毒性反应。多种神经变性疾病，都与氧化应激和谷氨酸兴奋性毒性密切相关。
　　 近来文献报道，Nrf2/ARE信号通路的激活可在多种组织中诱导一系列内源性的细胞保护基因上调，其中包括抗氧化酶、抗氧化蛋白、抗炎和解毒的蛋白。这些抗氧化酶和抗氧化蛋白在神经组织中的表达增加，可对抗由谷氨酸、过氧化氢及多巴胺引起的氧化损伤。因此Nrf2/ARE信号通路的激活有望成为神经变性疾病治疗的新靶点。
　　 白藜芦醇（resveratrol）是在葡萄的皮和种子中提取的一种植物抗毒素，其具有多种生物学活性：如抗氧化作用，神经保护作用，拮抗肿瘤增殖作用，心血管保护作用，激活延寿基因等作用。研究证实，白藜芦醇上述生物学活性中，最受关注的是抗氧化清除自由基和神经保护作用。
　　 本研究应用过氧化氢，利用脊髓星形胶质细胞原代培养建立细胞氧化应激模型，并以此为基础，深入研究白藜芦醇对过氧化氢诱导的细胞毒性的保护作用。以抗氧化和抗兴奋性毒性为切入点，观察白藜芦醇的神经保护作用。
　　 目的：利用原代小鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养，并应用H2O2诱导细胞发生氧化应激，模型建立后进行白藜芦醇药物干预，观察其干预后在抗氧化方面Nrf2/ARE通路下游经典抗氧化酶NQO1和GST以及核转录因子Nrf2总蛋白表达、totalNrf2 mRNA水平，细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量，以及细胞内活性氧簇（ROS）的荧光强度差异。在抗兴奋性毒性方面研究谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的蛋白表达以及培养液中谷氨酸含量的变化，探讨白藜芦醇在星形胶质细胞氧化应激条件下发挥的保护作用。
　　 方法：选用生后1-2天的ICR乳鼠脊髓组织进行体外培养，正常培养两周后进行纯化、传代，取第三代细胞进行干预。实验分为三组：正常对照组，模型组，药物干预组。对照组为单纯培养液，模型组加入25uM H2O2作用1小时，干预组先加入15uM白藜芦醇预处理24小时，再加入25uMH2O2作用1小时。分别收集各组的细胞培养液，进行乳酸脱氢酶（LDH）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）以及谷氨酸（glutamate）含量的测定。利用Western blot方法，检测NQO1、GST、核转录因子Nrf2总蛋白以及谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的的蛋白表达变化。应用RT-PCR检测白藜芦醇对正常星形胶质细胞核转录因子Nrf2 mRNA的表达水平作用。利用激光共聚焦检测各组中星形胶质细胞内活性氧簇（ROS）的荧光强度差异。
　　 结果：
　　 （1）模型组细胞在H2O2处理1小时后，NQO1，GST、totalNrf2蛋白表达较对照组明显降低（P<0.01）。白藜芦醇预处理后能够对抗H2O2对细胞的氧化损害，干预组NQO1、GST、total Nrf2蛋白表达水平与模型组相比明显增高（P<0.05）
　　 （2）白藜芦醇作用24小时后，Nrf2的mRNA水平和正常对照组相比能明显增高（P<0.05）。
　　 （3）H2O2处理1小时后，培养液中LDH含量较对照组明显升高（P<0.05），白藜芦醇预处理后LDH含量较模型组明显降低（P<0.05）。
　　 （4）细胞在H2O2处理1小时后，培养液中MDA含量较对照组明显升高（P<0.05），白藜芦醇预处理后能对抗H2O2对细胞的损害，MDA含量较模型组明显降低（P<0.01）。
　　 （5）H2O2处理1小时后，星形胶质细胞内活性氧簇（ROS）荧光强度较对照组明显升高（P<0.05），白藜芦醇预处理后细胞内活性氧簇（ROS）荧光强度较H2O2组明显降低（P<0.01）。
　　 （6）星形胶质细胞在H2O2处理1小时后，谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2蛋白表达较对照组明显降低（P<0.01），白藜芦醇预处理后干预组EAAT1和EAAT2蛋白表达水平与模型组相比明显增高（P<0.05）。白藜芦醇作用于星形胶质细胞24小时，谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2蛋白表达水平和正常对照组相比也能明显增高（P<0.05）。
　　 （7）H2O2处理1小时后，培养液中谷氨酸含量较对照组明显升高（P<0.01），白藜芦醇预处理后能对抗H2O2对细胞的损害，减少谷氨酸的释放增加其转运，培养液中谷氨酸含量较H2O2组明显降低（P<0.05）。
　　 结论：原代培养脊髓星形胶质细胞经H2O2处理后，细胞发生氧化损害，细胞内活性氧ROS产生增加，Ⅱ相解毒酶：NQO1和GST、总Nrf2、谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的蛋白表达较正常对照组下降，培养液中LDH、MDA和谷氨酸含量较正常对照组明显升高。给予白藜芦醇预处理星形胶质细胞后，清除细胞内ROS，干预组Ⅱ相解毒酶：NQO1和GST、总Nrf2、谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的蛋白表达较模型组升高，培养液中LDH、MDA和谷氨酸含量较模型组降低，并且白藜芦醇能够上调总Nrf2的mRNA表达水平和谷氨酸转运体EAAT1和EAAT2的蛋白表达水平。本研究证实了白藜芦醇能够通过抗氧化和抗兴奋性毒性来发挥对星形胶质细胞氧化损伤的保护作用，进而可以对邻近的运动神经元发挥保护作用，为神经变性疾病的治疗提供新策略。

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综述 星形胶质细胞氧化应激和兴奋性毒性在神经系统变性疾病中的作用和机制

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