转基因番茄的可见/近红外光谱快速无损检测方法

摘要

生物技术的快速发展，特别是基因工程技术的发展使得人类可以将外源基因插到受体物种的基因组中，从而使物种产生抗逆性、抗虫性及其它新的特性，这影响着人类生活的方方面面，包括农业、家禽业、工业和药业。全球转基因作物的种植面积和种类每年都在持续增长，但此项技术对生态环境、人类健康、伦理道德等可能带来的问题尚不明确，先需进行转基因生物检测和鉴别的相关技术研究。目前转基因生物的检测方法主要有DNA检测和蛋白质检测两大类，但这些方法存在较多不足，如操作复杂，费用高，且蛋白质检测方法只适合检测未加工的产品等。近红外光谱信息来源于有机分子中的含氢基团(C—H、O—H和N—H)振动的合频与各级倍频的吸收，应用其进行检测具有快速、无需复杂的样品预处理、低价和易实现在线等优点。
　　 转基因番茄是第一个获准进入市场的转基因农产品．本研究综合利用光谱分析技术、分子生物学、植物生理学、光学和化学计量学等诸多领域的知识，以转基因番茄(包括叶、果实、果汁和种子)及其亲本为研究对象，进行基于可见/近红外光谱技术的转基因番茄快速无损鉴别和生理特性指标(包括叶绿素和乙烯合成量)无损检测的研究。用不同的模式识别方法(判别分析(Discriminant analysis，DA)、判别偏最小二乘法(Discriminant partial least squares，DPLS)、簇类的独立软模式分类法(Softindependent modeling of class analogy，SIMCA)、前馈反向传播神经网络(Backpropagation neural network，BPNN)、径向基函数神经网络(Radial basis function neuralnetwork，RBFNN)和最小二乘支持向量机(Least sqares support vector machine，LS—SVM))进行转基因番茄与其亲本的定性分析，同时对叶片中叶绿素含量和番茄果实的乙烯合成量等生理特性指标与可见/近红外光谱的相关性进行研究，并利用主成分回归(Principal components regression，PCR)、偏最小二乘回归(Partial least squaresregression，PLSR)和多元线性回归(Multi linear regression，MLR)建立定量模型。本文的研究目的在于证明利用可见/近红外光谱分析技术进行转基因番茄快速无损鉴别和叶片中叶绿素含量及番茄乙烯合成量等生理特性指标定量检测的可行性，建立基于可见/近红外光谱分析技术的转基因番茄快速无损检测方法体系，为研发具有自主知识产权的转基因番茄高通量快速检测仪器提供方法依据。
　　 主要研究内容、结果和结论如下：
　　 (1)分析了光谱仪分辨率和扫描次数对近红外光谱和建模结果的影响。结果表明：分辨率为4 cm—1和8 cm—1时所建立的番茄果实鉴别模型的识别率最高，为78.89％；随着扫描次数的增加，光谱越来越光滑，均方根噪声逐渐变小，方差值也逐渐变小；模型的识别率随着扫描次数的增加而提高，扫描次数为128次时，模型的识别率最高；在α=0.05水平上分辨率大小和扫描次数对番茄果实近红外光谱噪声的影响显著，对吸光度的影响不显著。
　　 (2)分析了转基因番茄叶、果实、果汁和种子与其亲本的光谱差异．结果表明：用配有InGaAs检测器的Nexus智能型FT—NIR光谱仪所采集的转基因番茄叶与其亲本的漫反射光谱图上显示转基因番茄叶的吸光度值在1380 nm前小于亲本的吸光度值，但是在1380 nm后趋势有所改变；用配有Si检测器的Nexus智能型FT—NIR光谱仪所采集的转基因番茄叶与其亲本的可见/近红外漫反射光谱显示转基因番茄叶的吸光度值小于亲本的吸光度值；用微型光纤光谱仪USB4000所采集的番茄叶透射光谱图显示转基因番茄叶的透过率大于亲本的透过率；2)同一成熟期成熟番茄的近红外漫反射光谱图显示转基因番茄的吸光度值较其亲本高；不同成熟期番茄的可见/近红外漫反射光谱图显示转基因红番茄的吸光度值大于其亲本的吸光度值，转基因青番茄的光谱与其亲本在578 nm处交叉，在578 nm前，转基因青番茄的吸光度值大于其亲本的吸光度值，在578 nm后，转基因青番茄的吸光度值小于其亲本的吸光度值；3)转基因番茄汁与其亲本的近红外透射光谱极为相似，放大后能观察到微小差异；4)转基因番茄种子与其亲本的近红外原始光谱显示光谱之间有微小差异。结果表明，无论是转基因番茄叶、番茄果实、番茄汁还是番茄种子，它们的光谱与亲本的光谱间确实存在差异。
　　 (3)比较了不同仪器和检测方式对鉴别结果的影响。结果表明：1)用微型光纤光谱仪USB4000采集的漫反射光谱建立的转基因番茄叶与其亲本的鉴别模型的判别正确率最高，最适合用于转基因番茄叶与其亲本的鉴别．2)对于同一成熟期的转基因番茄与其亲本的鉴别，使用USB4000采集的漫反射光谱建立的模型对样本鉴别的正确率最高；对于不同成熟期的转基因番茄与其亲本的鉴别，同样是用USB4000采集的光谱建立的模型的鉴别正确率要高于FT—NIR光谱仪采集的光谱建立的模型．
　　 (4)比较了不同模式识别方法对转基因番茄叶、番茄果实、番茄汁和番茄种子定性分析结果的影响．结果表明：1)对转基因番茄叶与其亲本的判别结果显示，判别分析和判别偏最小二乘结合微分或标准规一化处理都可以实现对所有样本的正确分类。2)同一成熟期转基因番茄与其亲本的判别结果显示，判别分析建立的模型的鉴别效果最好，总体判别正确率为94％，前馈反向传播神经网络和最小二乘支持向量机模型的总体判别效果相同。对于不同成熟期的转基因番茄与其亲本的鉴别结果显示，SIMCA法所建模型的鉴别总体效果最好，为86.08％。3)对转基因番茄汁与其亲本的判别结果显示，结合二阶微分光谱，径向基函数神经网络和最小二乘支持向量机建立的模型预测精度最高，识别率均达到了100％。4)对转基因番茄种子与其亲本的鉴别结果显示，在全波段，判别分析结合25点平滑处理光谱所建的转基因番茄种子与其亲本鉴别模型的性能最优，对样本鉴别的总体正确率达到了95.81％。结果表明，利用可见/近红外光谱，可实现对转基因番茄与其亲本的鉴别。
　　 (5)用连续投影算法提取光谱特征波长后重新建立了转基因番茄与其亲本的鉴别模型。结果表明：随着波长数的增加，模型的判别正确率逐渐增加，但是运算所需的时间也逐渐增加。重建模型的结果显示：与模型重建前相比，对于同一成熟期转基因番茄与其亲本的鉴别，判别偏最小二乘法的重构模型的性能提高了，鉴别速度提高了45倍。对于不同成熟期转基因番茄与其亲本的鉴别，SIMCA方法建立的模型最优，总体判别正确率为84.36％。结果表明，利用连续投影算法提取光谱的特征波长后重新建立转基因番茄与其亲本的鉴别模型，可以提高鉴别速度。
　　 (6)对番茄叶叶绿素含量和番茄果实的乙烯合成量进行了定量分析。在剔除光谱异常样本和浓度异常样本的基础上，用PLSR、PCR和MLR方法建立了模型，比较了不同光谱预处理方法对模型的影响；对于番茄果实的乙烯合成量，还研究了不同建模波段对模型的影响。结果表明：1)番茄叶在全波段(670～1100 nm)的原始光谱所建的叶绿素含量的PLSR模型性能最优，相关系数r、校正均方根误差(Root meansquare error of calibration，RMSEC)、预测均方根误差(Root mean square error ofprediction，RMSEP)和交叉验证均方根误差(Root mean square error ofcross validation，RMSECV)分别为0.961、1.50、2.25和3.00.2)光谱经多元散射校正后在全波段范围内所建的PLSR模型最适合于乙烯合成量的定量分析，模型的相关系数r达到了0.904。结果表明，利用可见/近红外光谱结合化学计量学技术，可实现对番茄叶的叶绿素含量和番茄果实的乙烯合成量的定量分析。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、符号列表

声明

致谢

第1章 绪论

1.1课题背景

1.1.1转基因生物技术发展现状分析

1.1.2转基因生物的安全性问题

1.1.3转基因生物的管理办法

1.2转基因生物主要鉴别方法及存在的问题

1.2.1鉴别方法

1.2.2存在的问题

1.3可见／近红外光谱检测转基因生物的可行性

1.3.1近红外光的原理

1.3.2近红外光谱分析的一般流程

1.3.3可见／近红外光谱检测转基因生物的可行性

1.4光谱技术检测转基因产品的国内外研究进展

1.5近红外光谱分析数学模型的优化与维护方法

1.5.1近红外光谱分析数学模型的优化

1.5.2近红外光谱分析数学模型的维护

1.6国内外同类研究中存在的问题及借鉴之处

1.7研究对象、目的、内容和技术路线

1.7.1课题来源

1.7.2研究对象、目的和内容

1.7.3技术路线

1.8本章小结

第2章 材料与方法

2.1可见／近红外光谱采集的软硬件条件

2.1.1实验光谱仪介绍

2.1.2光谱数据分析软件介绍

2.2实验样品的制备

2.3样品内部品质指标理化分析及差异比较

2.3.1番茄叶叶绿素含量测定及比较

2.3.2番茄乙烯合成量的测定及比较

2.4光谱预处理方法

2.4.1平均

2.4.2平滑

2.4.3微分

2.4.4多元散射校正

2.4.5标准归一化

2.5异常样品剔除方法

2.6定性分析方法介绍

2.6.1主成分分析

2.6.2判别分析

2.6.3判别偏最小二乘法

2.6.4 SIMCA

2.6.5人工神经网络

2.6.6支持向量机

2.7定量分析方法介绍

2.7.1主成分回归

2.7.2偏最小二乘回归

2.7.3多元线性回归

2.8可见／近红外光谱特征波长提取

2.9本章小结

第3章 番茄可见／近红外光谱采集系统的建立和优化

3.1检测平台的搭建

3.1.1漫反射光谱技术及检测平台的搭建

3.1.2透射光谱技术及检测平台的搭建

3.2仪器参数的选择与优化

3.2.1分辨率对检测结果的影响

3.2.2扫描次数对检测结果的影响

3.3本章小结

第4章 转基因番茄可见／近红外光谱定性分析

4.1转基因番茄叶可见／近红外光谱鉴别

4.1.1光谱分析

4.1.2异常光谱剔除

4.1.3不同仪器和检测方式的鉴别结果比较

4.1.4不同模式识别方法的分析结果

4.2转基因番茄果实可见／近红外光谱鉴别

4.2.1同一成熟期转基因番茄果实的可见／近红外光谱鉴别

4.2.2不同成熟期转基因番茄果实的可见／近红外光谱鉴别

4.3转基因番茄汁近红外光谱鉴别

4.3.1光谱分析

4.3.2不同模式识别方法的结果分析

4.4转基因番茄种子近红外光谱鉴别

4.4.1光谱分析

4.4.2异常光谱剔除

4.4.3不同模式识别方法的结果分析

4.5本章小结

第5章 转基因番茄可见／近红外光谱定量分析

5.1番茄叶的叶绿素含量定量分析

5.1.1异常样本的剔除

5.1.2模型建立及精度分析

5.2番茄果实乙烯合成量定量分析

5.2.1异常样本的剔除

5.2.2模型建立及精度分析

5.3本章小结

第6章 结论与展望

6.1主要研究结论

6.2主要创新点

6.3进一步研究展望

参考文献

个人简历