姜黄素影响HT-29结肠癌细胞生长、增殖的分子机制研究

摘要

姜黄素是从天然植物—姜黄根茎中提取的一种多酚，具有抗氧化、消炎、抗肿瘤、预防老年性痴呆、治疗风湿等多种功效。本论文旨在研究姜黄素对HT—29结肠癌细胞生长、增殖及细胞存活率的影响，并在分子水平上研究姜黄素对HT—29细胞线粒体凋亡途径、β—catenin/Tcf—4信号途径活性的影响，从而探讨姜黄素抑制细胞生长、增殖的分子机制。
　　 本论文首先用倒置显微镜观察了10—80μM姜黄素处理对HT—29细胞生长的影响，结果发现姜黄素处理能够显著抑制细胞的生长。用Hoechst33258荧光染料染色也发现，姜黄素能够诱导HT—29细胞核浓缩，诱导细胞凋亡。对HT—29细胞线粒体膜电位及caspase—3活性的测定表明，10—80μM的姜黄素可以导致线粒体膜电位显著下降(P＜0.05)，caspase—3的活性显著提高(P＜0.05)。
　　 为了研究姜黄素抑制HT—29细胞生长增殖，诱导其死亡的分子机理，本研究运用RT—PCR技术研究了细胞线粒体凋亡途径相关蛋白mRNA的水平，结果表明，用高于40μM的姜黄素处理HT—29细胞，能够显著降低细胞中抗凋亡蛋白Bcl—2、Bcl—XL、survin mRNA的水平(P＜0.05)，促凋亡蛋白Bax mRNA的水平会显著升高(P＜0.05)，caspase—3 mRNA的水平则没有显著变化。Western—blotting结果则表明，10—80μM的姜黄素可以导致细胞中促凋亡蛋白Bad与Bax的水平显著升高，凋亡抑制蛋白Bcl—2、Bcl—xL及survivin的水平则明显下降；40μM以上的姜黄素处理HT—29细胞，可以激活其caspase—3，诱导PARP降解；Western—blotting结果还表明，10μM以上的姜黄素可以导致HT—29细胞线粒体细胞色素c的释放。以上结果表明，姜黄素可能通过线粒体途径诱导HT—29细胞凋亡。
　　 β—catenin/Tcf—4信号途径在大多数结肠癌细胞中异常激活，该通路可以激活多种原癌基因的表达，促进结肠癌细胞株生长、分化，为了研究姜黄素是否通过影响该信号途径的活性，抑制肿瘤细胞生长、分化，并可能诱导其凋亡。本论文用Western—blotting技术研究了姜黄素对细胞内β—catenin水平的影响，结果发现，姜黄素能够导致HT—29细胞内β—catenin裂解，从而降低细胞总β—catenin的水平，接着我们将免疫共沉淀技术(IP)和western—blotting技术相结合，研究了姜黄素对细胞核内β—catenin/Tcf—4复合物水平的影响，结果发现，姜黄素可以降低核内β—catenin/Tcf—4复合物的水平。此外，RT—PCR结果也表明，姜黄素处理能够显著降低β—catenin/Tcf—4的靶基因c—myc与cyclinD1 mRNA及蛋白质的水平(P＜0.05)，这说明姜黄能够下调β—catenin/Tcf—4的转录激活活性。用caspase—3的特异性小分子抑制剂Z—DEVD—FMK预处理HT—29细胞，则发现姜黄素诱导的β—catenin断裂被抑制；而β—catenin/Tcf—4下游靶基因的表达则不受Z—DEVD—FMK处理的影响，这说明，姜黄素诱导的HT—29细胞内β—catenin断裂是由caspase—3介导的，姜黄素诱导的β—catenin/Tcf—4转录激活能力下降则与caspase—3无关。
　　 本论文运用RT—PCR及western—blotting技术进一步研究了β—catenin/Tcf—4转录激活的靶基因PPARδ、VEGF、COX—2、14—3—3ε等的表达情况，结果表明，40—80μM的姜黄素处理可以显著下调靶基因PPARδ mRNA及蛋白质的水平(P＜0.05)，受PPARδ调节的基因14—3—3ε的表达水平也显著下降(P＜0.05)，而14—3—3ε在细胞中可以与促凋亡蛋白Bad结合，从而抑制凋亡，姜黄素下调14—3—3ε的水平可能与Bad的水平升高有关。同时，研究还发现，姜黄素处理可以显著下调β—catenin/Tcf—4信号路径VEGF和COX—2二个靶基因的水平，VEGF及COX—2均与结肠癌细胞的增殖、分化及血管形成密切相关，这进一步说明了姜黄素可能通过下调β—catenin/Tcf—4信号途径活性，来抑制结肠癌肿瘤细胞的生长与增殖。
　　 为了进一步研究姜黄素抑制HT—29细胞生长、增殖的分子机制，本论文研究了姜黄素的抗氧化及对HT—29细胞内活性氧水平的影响。用化学体系进行的实验证明，姜黄素可以猝灭DPPH、ABTS·+、O2·—、·OH等自由基，抑制亚油酸的过氧化反应，保护pBR322质粒DNA免受羟自由基的氧化损伤。用10—80μM姜黄素处理HT—29细胞后，我们测定了细胞内活性氧(ROS)及谷胱甘肽的水平，结果发现，姜黄素处理可以显著提高HT—29细胞内活性氧的水平，并激活caspase—3，下调Bcl—2的表达水平，诱导HT—29细胞凋亡(P＜0.05)。为研究姜黄素诱导的caspase—3激活及细胞凋亡是否与其刺激的胞内活性氧水平升高有关，本研究用抗氧化剂N—乙酰半胱氨酸(NAC)和过氧化氢酶(catalase)处理，以消除自由基，结果发现，NAC和catalase处理后，姜黄素不能诱导caspase—3激活，姜黄素处理导致的细胞存活率下降也被抑制。
　　 本论文研究表明，姜黄素可能是通过刺激HT—29细胞产生高水平的活性氧，激活caspase—3，从而激活HT—29细胞线粒体凋亡途径；姜黄素还可以通过不依赖于caspase—3方式，下调β—catenin/Tcf—4信号活性，抑制其下游靶基因的表达，从而抑制HT—29结肠癌细胞的生长、增殖。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

第一章 文献综述

1 姜黄素的理化性质

2姜黄素的生理活性作用

2.1 姜黄素具有消炎，治疗风湿的作用

2.2姜黄素能够降低正常人血清胆固醇和脂质过氧化物水平，调节心脑血管功能

2.3 姜黄素能够预防胆结石的产生

2.4姜黄素能够有助于肠道易激综合症和感染性肠道疾病的预防和治疗

2.5 姜黄素有助于改善移植早期的肾脏功能

2.6 姜黄素能够改善老年人的脑功能，提高其认知能力

2.7姜黄素可以治疗皮肤银屑癣等疾病

2.8 姜黄素能够抑制多种肿瘤细胞株生长、增殖，诱导其凋亡

3 姜黄素抑制肿瘤细胞生长分化，诱导其凋亡的机制

3.1 姜黄素影响细胞内某些转录因子表达，降低其转录激活能力

3.2姜黄素能够抑制多种激酶的活性

3.3 姜黄素可以调节肿瘤生长、转移相关基因的表达

3.4 姜黄素影响肿瘤细胞凋亡、侵袭及粘附相关基因的表达及信号通路的调节

3.5 姜黄素能够调节与肿瘤生长有关酶的活性

4姜黄素抑制结肠癌细胞生长、增殖，诱导其凋亡的机制

4.1 姜黄素能够诱导结肠癌细胞凋亡和细胞周期阻滞

4.2姜黄素能够抑制结肠癌细胞血管形成、转移及侵袭

4.3 姜黄素对结肠癌细胞相关信号通路的影响

5 姜黄素的抗氧化及助氧化作用

6本论文的研究目的与研究内容

参考文献

第二章 姜黄素对HT-29细胞线粒体凋亡信号途径的影响研究

1 引 言

2材料与方法

2.1 材 料

2.2方 法

3 结 果

3.1 姜黄素对HT-29细胞生长增殖情况的影响

3.2姜黄素对HT-29细胞存活率的影响

3.3 姜黄素处理对HT-29细胞核形态的影响

3.4姜黄素对caspase-3活性的影响

3.5 姜黄素对HT-29细胞线粒体膜电位(△ψm)的影响

3.6 姜黄素对HT-29细胞中凋亡因子mRNA水平的影响

3.7姜黄素对HT-29细胞质中细胞色素c水平的影响

3.8姜黄素对细胞中Bad、Bax、caspase-3、Bcl-2、Bcl-xL、survivin和PARP蛋白表达的影响

4讨 论

5 小 结

参考文献

第三章姜黄素对HT-29细胞β-catenin/Tcf-4信号途径的影响研究

1 引 言

2材料与方法

2.1 材料

2.2方 法

3 结 果

3.1 姜黄素对HT-29细胞内β-catenin水平的影响

3.2姜黄素对HT-29细胞核内β-catenin/Tcf-4复合物水平的影响

3.3 姜黄素对β-catenin/Tcf-4信号途径的影响

3.4 Caspase-3抑制因子Z-DEVD-FMK对姜黄素诱导的β-catenin/Tcf-4信号途径下调的影响

4讨 论

5小 结

参考文献

第四章 姜黄素对HT-29细胞β-catenin/Tcf-4途径靶基因表达的影响研究

1 引 言

2材料与方法

2.1 材 料

2.2 方 法

3结果

3.1 提取的总RNA结果观察

3.2姜黄素处理对HT-29细胞内PPARδ表达的影响

3.3姜黄素处理对HT-29细胞内14-3-3ε表达的影响

3.4姜黄素处理对HT-29细胞VEGF与COX-2表达的影响

4讨 论

5 小 结

参考文献

第五章 姜黄素的抗氧化作用及其对HT-29细胞活性氧水平的影响研究

1 引 言

2材料与方法

2.1 材 料

2.2 方 法

3 结 果

3.1 姜黄素的总还原力

3.2 姜黄素对DPPH自由基的猝灭能力

3.3 姜黄素对ABTS+自由基的猝灭能力

3.4超氧阴离子自由基(O2)猝灭能力

3.5 姜黄素对羟自由基(OH)清除效果

3.6姜黄素对亚油酸氧化的抑制效果

3.7姜黄素羟自由基所致的DNA损伤的影响

3.8 姜黄素HT-29细胞内活性氧水平的影响

3.9姜黄素对HT-29细胞内谷胱甘肽水平的影响

3.10 抗氧化剂处理对姜黄素诱导的H1229细胞存活率、胞内ROS水平、Caspase-3活性及Bcl-2水平的影响

3.11 Z-DEVD-FMK处理对HT-29细胞存活率、胞内ROS水平及Caspase-3活性的影响

4讨 论

5 小 结

参考文献

第六章 总结与展望

本论文的主要创新点

作者简历及在学期间所取得的科研成果