抗重组VP28囊膜蛋白单克隆抗体的制备及在对虾白斑综合征病毒检测中的应用

摘要

对虾白斑综合征(WSS)是全球对虾养殖业所面临的危害最大,传播最广的病害之一,至今已席卷了整个世界的对虾养殖地区,造成了巨大的经济损失。但目前尚无良好有效的防治手段,因此早期检测和预防WSS成为近年来的研究热点。本研究主要克隆、表达了其病原对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了单克隆抗体(单抗),同时对制备的单抗在wssv检测中的应用进行了初步探索,研究结果将为对虾自然感染WSSV状况检测和监测提供技术支撑,对了解病毒的感染与传播,进而控制该病毒的继续蔓延有重要的意义,研究内容和结果如下:1)采用改良的差速离心法从人工感染WSS的克氏原螯虾中分离纯化了WSSV。完整的病毒外包被着囊膜,长约300～400nm,直径约100～120 nm。失去囊膜剩下的核衣壳呈螺旋圆柱体形,长约300～450 nm,直径约80～90 nm。纯化的病毒形态和大小与先前报道的结果相似。2)以纯化病毒基因组为模板,通过特定引物的设计,利用PCR扩增技术,克隆得到了完整的WSSV囊膜蛋白VP28基因,把该VP28基因在大肠杆菌中进行表达并用Ni-NTA柱纯化后,分别用SDS-PAGE和Western Blot进行蛋白鉴定。结果显示表达产物均出现了与预测大小一致特异性条带,表明VP28基因成功在大肠杆菌中进行了有效表达。3)利用纯化的重组VP28蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞,并克隆了能稳定分泌强阳性单克隆抗体的一株杂交瘤细胞株anti-rVP28 MAb。通过ELISA和免疫电镜对单抗的特异性进行了分析,结果表明所制得的单抗可以特异性地与WSSV上的VP28蛋白结合,说明用重组VP28蛋白抗原刺激筛选得到的单抗能识别天然的VP28蛋白表位,可用于WSSV的检测。4)通过Dot-blotting对WSSV进行快速的检测试验,发现anti-rVP28 MAb能有效地检测WSSV。竞争性PCR结果表明anti-rVP28 MAb检测WSSV的极限为病毒量104拷贝,这为WSSV感染的早期检测提供了可能。

目录

致谢

本文主要英文缩写词

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第一章 前言

1 对虾白斑综合征和对虾白斑综合征病毒

1.1 对虾白斑综合征的病理特征及病理变化

1.2 对虾白斑综合征病毒的基本特征

1.3 WSSV分子生物学进展

1.4 WSS的诊断

2 单克隆抗体研究进展

2.1 抗体与单克隆抗体

2.2 单克隆抗体的制备与运用

2.3 单克隆抗体在对虾病毒检测中的应用

3 本研究的目的与意义

第二章 对虾白斑综合征病毒的分离纯化

1 试验材料

1.1 种毒来源

1.2 试验动物

1.3 培养基及主要化学试剂的配制

1.4 其它材料

2 试验方法

2.1 种毒处理

2.2 病毒在螯虾体内的增殖

2.3 螯虾鳃组织基因组提取

2.4 引物设计(检测用)

2.5 PCR反应体系和条件

2.6 PCR产物的凝胶电泳

2.7 病毒的分离纯化

2.8 电镜观察

3 试验结果

3.1 螯虾接种后的临床症状

3.2 PCR检测结果

3.3 纯化病毒粒子的形态学观察

4 讨论

4.1 WSSV的增殖

4.2 WSSV的分离纯化

4.3 WSSV病毒粒子的形态观察

第三章 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因在大肠杆菌中的表达及纯化

1 基因克隆及表达策略

1.1 基因克隆策略

1.2 基因表达策略

2 试验材料

2.1 病毒

2.2 菌种和质粒

2.3 引物设计:

2.4 培养基及主要化学试剂的配制

2.5 其他试剂

3 试验方法

3.1 WSSV基因组提取

3.2 PCR反应体系及条件

3.3 DNA电泳

3.4 目的片段的割胶回收

3.5 DNA片段与T载体连接

3.6 感受态细胞的制备

3.7 连接产物转化

3.8 重组质粒的提取与鉴定

3.9 测序

3.10 重组克隆质粒和表达载体酶切

3.11 目的片段与表达载体连接

3.12 连接产物转化表达宿主菌

3.13 阳性表达子的筛选

3.14 阳性表达子的诱导表达

3.15 表达产物的SDS-PAGE检测

3.16 表达产物的Western blot分析

3.17 表达产物的纯化

4 试验结果

4.1 VP28基因的克隆

4.2 VP28核苷酸序列分析

4.3 表达产物的SDS-PAGE和Western blot检测和纯化分析

5 讨论

5.1 VP28基因克隆

5.2 VP28基因在大肠杆菌中的表达及纯化

第四章 抗重组VP28蛋白的单克隆抗体制备及鉴定

1 试验材料

1.1 实验动物

1.2 主要化学试剂的配制

2 试验方法

2.1 单克隆抗体的制备

2.2 单克隆抗体特异性的检测

3 试验结果

3.1 VP28包被浓度确定及免疫血清效价测定

3.2 单抗的免疫胶体金观察

4 讨论

第五章 抗重组VP28蛋白单克隆抗体对WSSV的检测

1 试验材料

1.1 病毒

1.2 抗重组VP28蛋白单克隆抗体

1.3 试剂

1.4 其他材料

2 试验方法

2.1 Dot blotting

2.2 抗重组VP28蛋白单克隆抗体的特异性检测

2.3 抗重组VP28蛋白单克隆抗体的敏感性检测

2.4 竞争性PCR检测

3 试验结果

3.1 抗重组VP28蛋白单克隆抗体的特异性检测

3.2 抗重组VP28蛋白单克隆抗体的敏感性检测

3.3 竞争性PCR检测

4 讨论

参考文献

附录一 pUCm-T Vevtor

附录二 pET-30a(+)Vevtor

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