糖皮质激素-聚乙烯亚胺作为新型基因给药系统的研究

摘要

本研究旨在利用糖皮质激素(GC)与细胞质中糖皮质激素受体(GR)特异性结合后转移入细胞核的能力，合成一种具有细胞核靶向能力，低毒、高效的新型阳离子非病毒基因给药载体，并考察了其体内体外的转染效果。采用了效价(potency)和LogP评价GC结构与转染结果的关系。
　　 利用Traut's试剂将5种糖皮质激素：倍他米松(BEX)，地塞米松(DEX)，甲基泼尼松龙(MPL)、泼尼松龙(PNL)和氢化可的松(HC)接枝到PEI1800，得到了5种GC-PEIs，取代度都在1左右。
　　 通过琼脂糖凝胶电泳，缓冲能力擦拭，DLS粒径测定和Zeta电位测定实验检测了GC-PEIs/pDNA的理化性质，五种GC-PEIs与pDNA的复合物理化性质相似。然而，体外HEK293和HepG2两种细胞系上的细胞毒性和转染效率测定结果都证实了GC的修饰显著提高了PEI1800的转染效率，但是五种GC之间有明显差异。针对GC的结构与转染效果的关系考察，采用了分子模拟对接程序考察了5种GC和GR的结合情况，并比较了用效价和LogP值来评价转染效果的可行性。
　　 同时，采用激光共聚焦显微镜对载体在细胞内进行定位，发现BET-PEI基本实现了细胞核靶向的目的。小鼠体内肝门静脉注射BET-PEI包载pEGFP-N1复合物，倒置荧光显微成像和流式细胞术FCM测定都再一次证明了。BET-PEI能显著提高转染效率，并超过PEI25k的水平。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

第一章 引言

1.1非病毒基因载体

1.2糖皮质激素

1.3研究工作的提出

第二章 载体材料的合成与表征

2.1实验材料与仪器

2.1.1材料与试剂

2.1.2仪器

2.2载体的合成

2.2.1糖皮质激素-甲磺酸酯(GC-Mesylate)的合成与表征

2.2.2糖皮质激素-聚乙烯亚胺(GC-PEI)的合成与表征

2.3结果与讨论

2.3.1 GC-mesylates的1H-NMR鉴定

2.3.2 GC-PEIs的1H-NMR鉴定

2.3.3 GC-mesylates和GC-PEIs的红外光谱鉴定

2.4本章小结

第三章 载体材料的性能评价

3.1实验材料与仪器

3.1.1材料与试剂

3.1.2仪器

3.2载体材料及其与DNA复合物性能的研究

3.2.1载体材料缓冲能力的测定

3.2.2 GC-PEI/pDNA复合物凝胶电泳阻滞实验

3.2.3 GC-PEI/pDNA复合物粒径的测定

3.2.4 GC-PEI/pDNA复合物Zeta电位的测定

3.2.5 BET-PEI/pDNA复合物形态的观察

3.3结果和讨论

3.3.1质粒DNA的提取

3.3.2载体材料缓冲能力

3.3.3 GC-PEI/pDNA复合物凝胶电泳阻滞实验

3.3.4 GC-PEI/pDNA复合物的粒径

3.3.5 GC-PEI/pDNA复合物的Zeta电位

3.3.6 GC-PEI/DNA复合物的形态观察

3.4本章小结

第四章 载体材料细胞毒性评价与体外转染实验

4.1材料与仪器

4.1.1材料和试剂

4.1.2仪器

4.2细胞毒性实验

4.3载体的体外报告基因转染试验

4.3.1虫荧光素酶(pGL3)报告基因的转染

4.3.2 BCA法测定细胞总蛋白及比荧光值计算

4.3.3绿色荧光蛋白(pEGFP-N1)报告基因的转染

4.4糖皮质激素介导的基因转染细胞内定位

4.4.1载体的荧光标记

4.4.2荧光标记载体的细胞内定位

4.5结果和讨论

4.5.1载体的细胞毒性

4.5.2 pGL3报告基因转染结果

4.5.3 pEGFP-N1报告基因转染结果

4.5.4载体的细胞内定位

4.6本章小结

第五章 分子模拟对接与体内转染实验

5.1材料与试剂

5.1.1材料、试剂和软件

5.1.2仪器

5.2计算机分子模拟对接(Molecular docking)

5.3小鼠体内转染实验

5.4结果和讨论

5.4.1分子模拟对接(Molecular docking)

5.4.2转染结果的荧光观察

5.4.3转染结果的流式分析

5.5本章小结

结论

参考文献

综述 非病毒基因载体的研究进展

作者简历