AIF和EndoG介导的线粒体相关问号钩端螺旋体诱导巨噬细胞凋亡的研究

摘要

目的：致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)可以在体外诱导小鼠单核巨噬细胞系J774A.1细胞凋亡，但是具体的凋亡机制还未阐明。本研究的目的是探讨AIF和EndoG线粒体相关途径在问号钩体诱导的巨噬细胞凋亡中的作用。
　　 方法：⑴致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株体外诱导巨噬细胞凋亡：钩体分别与小鼠腹腔巨噬细胞(MPMs)，小鼠单核巨噬样细胞系J774A.1细胞，人单核样细胞系THP-1细胞，共同孵育。采用AnnexinV-FITC和PI双染法，通过流式细胞仪检测钩体感染后巨噬细胞凋亡率。⑵透射电镜观察诱导凋亡的巨噬细胞超微结构改变，尤其是线粒体改变。⑶应用活性检测试剂盒测定钩体感染后的巨噬细胞的caspase-8，caspase-9活性变化；非特异性Caspase阻断剂对凋亡的影响；JC-1染色后流式细胞仪和荧光显微镜检测线粒体膜电位(MPT)变化，应用荧光探针DCFH-DA检测细胞内的活性氧(ROS)水平。⑷Western blot分别检测诱导钩体感染后的巨噬细胞在感染不同时间后的线粒体或胞浆成份中的细胞色素C，EndoG，AIF和Smac的表达，同时应用免疫荧光染色法检测相应蛋白的转位。MPT阻断剂预处理细胞后，对凋亡及线粒体释放蛋白的影响。(5)应用基因芯片技术检测钩体感染后的巨噬细胞的凋亡相关基因Bcl-2家族的mRNA表达水平变化，对表达发生变化的及代表性Bcl-2家族基因的应用Real-time PCR再次确认mRNA水平变化。
　　 结果：①致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株体外能成功诱导巨噬细胞凋亡，显示问号钩体赖株可诱导3种巨噬细胞均出现不同程度的细胞凋亡，细胞凋亡率在一定范围内，随着感染时间延长和感染菌量的增加而升高。但是感染菌量过高时，细胞凋亡率开始下降，同时细胞坏死率升高。②透射电镜结果显示：感染问号钩体后，3种巨噬细胞均出现细胞凋亡的特征，例如染色质浓缩和边缘化，新月形核，细胞空泡化，细胞线粒体肿胀和嵴消失，但是3种被感染巨噬细胞的形态改变之间无明显差异。③问号钩体赖株感染3种巨噬细胞后，均可检测到caspase-8活性明显升高，caspase-9活性无明显升高；但是非特异性caspase抑制剂不能完全阻断细胞凋亡。被钩体感染后，3种巨噬细胞线粒体膜电位均随着感染时间的延长而逐渐下降。其中，MPMs的MPT下降幅度大于J774A.1和THP-1细胞。此外，与正常对照细胞相比，被钩体感染的3种巨噬细胞均出现胞内活性氧(ROS)水平升高。④Westem Blot显示，在问号钩体赖株诱导3种巨噬细胞凋亡的过程中，在MPMs和J774A.1细胞中检测到AIF和EndoG从线粒体释放到胞浆，在THP-1细胞中检测到AIF从线粒体释放到胞浆；但是未检测到细胞色素C和Smac从线粒体释放到胞浆。但是免疫荧光染色证实钩体感染后AIF或EndoG从线粒体转位到细胞核，从而诱导细胞凋亡的发生。MPT阻断剂可以部分性阻断细胞凋亡，完全阻断AIF或EndoG的释放。⑤线粒体相关的凋亡调节蛋白，Bcl-2家族的mRNA表达水平检测结果显示：钩体感染后3种巨噬细胞后，Bcl-2家族抗凋亡基因Bcl-2，Bcl-XL均无明显变化，但是促凋亡基因Bid，Bikl，Bnip3，Bcor，Bcl-211和Bclafl在MPMs和J774A.1细胞中表达明显上调，促凋亡基因Bid， Bikl，Bnip3， Bcl-211和Bclafl在THP-1细胞中小幅上调，其他促凋亡基因无明显变化。
　　 结论：⑴致病性的问号钩体黄疸出血群赖型赖株可以诱导巨噬细胞凋亡。⑵问号钩体赖株通过caspase依赖的caspase-8途径和线粒体相关的非caspase依赖途径诱导巨噬细胞凋亡。⑶Bcl-2家族在问号钩体赖株诱导细胞凋亡的过程中，一些促凋亡基因mRNA转录水平上调，可能参与凋亡的调控，具体机制有待进一步研究。

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致谢

引言

第一部分 细胞的培养及钩体培养

1.1细胞系和菌株来源

1.2实验动物

1.3主要试剂及仪器

1.4细胞的培养、传代和细菌培养

第二部分 问号钩端螺旋感染巨噬细胞及细胞凋亡检测

2.1主要试剂及仪器

2.2实验方法

2.3结果

第三部分 问号钩体感染细胞凋亡的途径研究

3.1主要试剂和仪器

3.2实验方法

3.3结果

第四部分 Bcl-2家族基因mRNA转录水平变化

4.1主要试剂与仪器

4.2实验方法

4.3结果

第五部分 结论

第六部分 讨论

参考文献

综述 莱姆螺旋体可能的致病机制

作者简历及在读期间所取得的科研成果