基因内microRNA miR-483-3p在诱导巨噬细胞凋亡中的应用

摘要

本发明公开了基因内microRNA miR‑483‑3p在诱导巨噬细胞凋亡中的应用，诱导miR‑483‑3p上调能通过抑制靶基因MED1，使其转录调控的下游促凋亡分子p53和p21表达升高，从而促进巨噬细胞凋亡，同时，上调的主基因IGF2也能促进巨噬细胞凋亡。这些研究有助于深入理解内含子miRNA在ROS引起的巨噬细胞功能紊乱中的作用，揭示其在AS发生发展中的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因内microRNA miR-483-3p在诱导巨噬细胞凋亡中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

冠心病和脑卒中等心脑血管疾病是严重危害人类健康的“头号杀手”，动脉粥样硬化(AS)是这些疾病的关键病理基础之一。AS的发病机制十分复杂，免疫炎在其中发挥关键作用。作为关键的免疫炎症细胞，巨噬细胞从初期的脂质条纹，到末期的斑块破裂或糜烂，在AS发生发展的全过程都发挥核心作用。目前认为巨噬细胞凋亡在AS病变早期是保护因素，能减轻早期动脉粥样硬化的发展；而在AS病变晚期则加剧AS进程，导致斑块不稳定，促使坏死核心形成，增加形成血栓的风险。影响巨噬细胞凋亡的因素及其机制非常复杂包括各种环境信号、细胞因子、脂质及其衍生物等，在AS发生发展过程中巨噬细胞凋亡的机制仍未完全阐明。因此，有必要对AS中巨噬细胞的凋亡机制开展更深入的研究。

活性氧类(ROS)是需氧细胞氧化呼吸代谢的产物，包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等。生理浓度的ROS作为信号分子，在各种细胞功能调控中发挥关键作用。如ROS能刺激破骨细胞活性，促使其分化。然而，过量ROS则引起氧化应激，导致细胞功能异常，如细胞迁移、增殖和凋亡异常等，这也是包括AS在内的多种心血管疾病的重要发病机制

内含子miRNA是位于蛋白编码基因(host gene)内含子上的一类miRNA，一般与主基因受同一启动子调控，表达模式一致，协同调控细胞功能。miR-483-3p是位于IGF2基因内含2的典型内含子miRNA，并被报道参与多种代谢性疾病和肿瘤的发生发展。如在鼠源3T3-L1细胞系中过表达miR-483-3p能通过限制脂肪细胞的脂质存储而引发脂毒性和胰岛素抵抗；抑制miR-483-3p则能促进内皮祖细胞归巢。miR-483-3p在肾母细胞瘤、结肠癌、肝癌等中过表达，能抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤发生。但也有研究显示miR-483-3p促进肿瘤细胞凋亡，抑制增殖，从而抑制肿瘤发病。此外，miR-483-3p在人小梁网细胞中能抑制靶基因Smad4表达，从而对抗氧化应激对细胞外基质的上调。这些结果提示miR-483-3p的功能复杂，在不同种类的细胞和环境因素下的作用可能不同甚至相反。目前仍未有miR-483-3p在氧化应激诱导巨噬细胞凋亡中作用和机制的报道。

发明内容

本发明为解决上述内容，提供基因内microRNA miR-483-3p在诱导巨噬细胞凋亡中的应用，诱导miR-483-3p上调能通过抑制靶基因MED1，使其转录调控的下游促凋亡分子p53和p21表达升高，从而促进巨噬细胞凋亡，同时，上调的主基因IGF2也能促进巨噬细胞凋亡。

基因内microRNA miR-483-3p在诱导巨噬细胞凋亡中的应用。

进一步的，上述基因内microRNA miR-483-3p的序列为SEQ ID NO.1。

基因内microRNA miR-483-3p诱导巨噬细胞凋亡的方法，包括如下步骤：上调巨噬细胞内基因内microRNA miR-483-3p的表达，从而抑制其靶基因MED1表达，进而上调MED1调控的p53/p21促进ROS诱导的巨噬细胞凋亡。

本申请还可以提供基因内microRNA miR-483-3p在缓解高浓度H

进一步的，上述应用的应用方法为：下调基因内microRNA miR-483-3p在巨噬细胞中的表达。

有益效果：

本发明明确显示miR-483-3p的上调能抑制其靶基因MED1的表达而增强P53依赖的凋亡通路，促进ROS诱导的巨噬细胞凋亡。主基因IGF2促进了miR-483-3p的上述作用。我们的研究有助于深入理解内含子miRNA在ROS引起的巨噬细胞功能紊乱中的作用，揭示其在AS发生发展中的作用。

附图说明

图1 miR-483-3p促进氧化应激诱导的巨噬细胞凋亡。

图2 miR-483-3p预测的靶基因参与多种生物过程。

图3 MED1是miR-483-3p靶基因。

图4 miR-483-3p通过MED1-p53/p21轴与其主基因IGF2促进ROS诱导的巨噬细胞凋亡。

图5 miR-483-3p通过MED1-p53/p21轴及其主基因IGF2协同促进ROS诱导的巨噬细胞凋亡机制图.

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例

1.材料方法

1.1细胞系和细胞培养

实验所用细胞系(HEK293T,RAW264.7)均从中国科学院上海细胞库购买。这些细胞复苏后都在含10％的胎牛血清中培养，所有细胞均在37℃和5％CO2的孵箱中培养。

1.2细胞处理和转染

H

1.3 RNA提取以及RT-PCR

用Trizon法提取细胞总RNA，RNA浓度测定用Nanodrop 2000c分光光度计(ThermoFisher Scientific).miR-483-3p的表达分析用锁核酸技术(takara,Japan)。逆转录试剂盒Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit(638315,Clotech,Kusatsu,Japan)和RT-PCR试剂盒Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit(638314,Clotech,Kusatsu,Japan)用于miRNA特异性cDNA合成和PCR扩增。人源和鼠源RNU6B分别作为内源参考基因。MED1,IGF2,P53和P21的mRNA表达用PrimeScript RT Master Mix(RR036B,Takara,Kusatsu,Japan)和TB Green Premix Ex Taq II(RR420A,Takara)在CFX96 real-time PCR system荧光定量PCR仪上(Bio Rad,Hercules,USA)进行。β-actin作为mRNA的内参。每个样品检测重复3次。使用2-ΔΔ CT值计算表达量的倍数变化。本实验所用引物均列在表1。

表1:本研究所用引物

1.4 Western Blot

细胞转染48小时后收集细胞，用含蛋白酶抑制剂(11836153001,Roche,Mannheim,Germany)的RIPA裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.5,2mM EDTA,100mM NaCl,50mM NaF,1％Triton X-100,1mM Na3VO4,and 40mMβ-glycerol phosphate)裂解。总蛋白的浓度用BSA方法测定。上样蛋白量为20μg总蛋白，而后8％or 10％SDS-PAGE胶分离总蛋白，随后转移到PVDF膜上(BioRad,Berkeley,USA)。电转后的PVDF膜用5％脱脂奶粉封闭2小时，而后分别用相应一抗4℃孵育过夜：β-Actin(sc-47778,santa cruz biotechnology,1:5000),Anti-MED1(phospho T1457)(ab60950,Abcam,1:1000)。次日，相应的二抗(SA00001-1,SA00001-2,Proteintech,1:1000)孵育1小时.ChemiDoc XRS+imaging system(Bio-Rad,Hercules,USA)仪器上检测条带。Image pro plus 6.0软件(Media Cybernetics,Rockville,USA)分析蛋白条带灰度值。

1.5双荧光素酶报告实验

PCR扩增含预测的miR-483-3p结合位点的鼠源MED1 3'UTR序列。利用PCR技术突变MED1 3'UTR序列中miR-483-3p的结合位点，产生突变的MED1 3'UTR(Mut)。将包含miR-483-3p预测结合位点的野生(WT)和突变(MUT)序列的MED1 3'UTR序列分别克隆至pmir-GLO载体(Promega)。然后，Lipofectamine 3000试剂盒(L3000015,Life Technologies,Carlsbad,USA)和Lipofectamine RNAiMAX试剂盒(13778150,Life Technologies)共转染miR-483-3pmimics or miR-483-3p-NCs以及上诉对应质粒到HEK-293T细胞中。48小时后用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)在Centro LB 960MicroplateLuminometer(Berthold,Germany)仪器上分析荧光值。

1.6细胞凋亡

RAW264.7的细胞凋亡率用试剂盒FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD,556547)。不同处理的细胞按1×10

1.7数据分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism Software(GraphPad Software Inc.,SanDiego,CA,USA)进行。数据表示为平均值±SEM，两组间统计分析用Student's t-test，多组间检测用ANOVA。Pearson correlation检测相关性。P＜0.05表示具有统计学意义。所有实验独立重复至少三次。

2.结果

2.1 miR-483-3p促进活性氧诱导的巨噬细胞凋亡

图1中的A和B是用生理浓度10nM(CTR)和100μM H2O2分别处理小鼠巨噬细胞株RAW264.7，用流式细胞仪检测细胞凋亡(图1中的A),qPCR检测miR-483-3p表达量(图1中的B)。(图1中的A和B)Pearson相关分析miR-483-3p的表达变化与双氧水的浓度(图1中的C)及巨噬细胞凋亡(图1中的D)的关系。(图1中的E)转染miR-483-3p、inhibitor及其相应NC后RAW264.7细胞凋亡的变化。(图1中的F)转染miR-483-3p、inhibitor以及NC对100μM H2O2处理的RAW264.7细胞凋亡的影响。NC:negative control for miR-483-3p；NC-IHT:negativecontrol for miR-483-3p inhibitor。数据均用平均值±SEM表示.Student's t和ANOVA检验用于检验差异显著性,n＝6.***:p<0.001

H

2.2预测miR-483-3p参与多种生物学功能和通路包括细胞凋亡

(图2中的A)argetScan、miRWalk、miRDB三个miRNA靶基因预测工具预测的miR-483-3p潜在靶基因的韦恩图。(图2中的B和C)argetScan、miRWalk、miRDB三个miRNA靶基因预测工具都预测的45个miR-483-3p潜在靶基因生物过程与分子功能(图2中的B)和KEGG信号通路(图2中的C)的富集分析。颜色灰度的深浅代表富集通路中的P值(p<0.05)。X轴数字表示-log(PValue)。*:p<0.05,***:p<0.01,***:p<0.001.

为进一步揭示miR-483-3p促进双氧水诱导的巨噬细胞凋亡的机制，miR-483-3p的靶基因的预测用常用的靶基因预测软件TargetScan,miRWalk and miRDB。为提高预测结果的准确性，选择这三个软件预测的miR-483-3p靶基因结果的交集作为miR-483-3p的潜在靶基因。取三个软件预测的45个交集基因为miR-483-3p的潜在靶基因图2中的A)。这45个miR-483-3p潜在靶基因的功能富集分析表明miR-483-3p涉及很多重要的生物学功能,其中包括细胞凋亡,细胞内脂质和胆固醇转运,LDL结合,细胞对应ROS和免疫的反应(图2中的B)。其中细胞凋亡的调控富集最为显著。另外,这些miR-483-3p潜在靶基因的功能也在多条调控炎症和细胞增殖与凋亡的关键信号通路上显著富集，如NF-κB,Noth1,Wnt,P53 and IGF1通路等(图2中的C)。这些结果提示miR-483-3p可能涉及多种功能，特别是在免疫炎症的调控中发挥重要作用。

2.3 miR-483-3p靶向MED1并在巨噬细胞中抑制其表达

图3中的A显示MED1 3’-UTR内预测的miR-483-3p结合位点以及结合能。绿色字母表示3’-UTR内与miR-483-3p种子区域互补的序列；红色字母表示用于构建双荧光素酶报告载体的3’-UTR内miR-483-3p结合序列的突变位点。图3中的B和C是100μM H2O2处理RAW264.7细胞后MED1在mRNA(B)和蛋白(C)水平上的表达变化。CTR为生理浓度H

TargetScan等多个靶基因预测软件都显示MED1是miR-483-3p的潜在靶基因。RNAhybrid的分析结果也表明MED1 3'-UTR序列中存在与miR-483-3p种子序列的结合位点，而且结合能低至-22.4kcal/mol(图3中的A)。这提示MED1很可能是miR-483-3p的靶基因。另外，高浓度(100μM)H

2.4 miR-483-3p通过MED1-p53/p21轴及其主基因IGF2协同促进ROS诱导的巨噬细胞凋亡

图4中的A图示miR-483-3p与宿主基因IGF2在基因组的位置。图4中的B显示了100μM H2O2处理RAW264.7细胞后IGF2在mRNA水平的变化。CTR：生理浓度H2O2(10nM)处理的细胞。图4中的C显示Pearson相关分析IGF2与miR-483-3p的mRNA表达变化关系。图4中的D显示转染miR-483-3p后加和不加IGF2蛋白对100μM H

miR-483-3p位于IGF2基因的第二个内含子，是典型的内含子miRNA(图4中的A)。巨噬细胞用100μM H

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省立医院

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