基于DnaE内含肽的定量检测GPCRs内吞方法的建立

摘要

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)家族参与了机体内多种生理过程的调节，是治疗多种人类疾病的主要药物靶点。检测非G蛋白亚基依赖的G蛋白偶联受体的内吞可用于研究受体激动剂的活性。本论文首先从蓝细菌克隆到新的DnaE内含肽并鉴定其自我剪接功能；此后我们建立了一种新型的定量分析GPCRs内吞的方法，该方法基于Npu-DnaE内含肽介导的蛋白剪接而重组断裂Renilla荧光素酶活性和被配体活化的受体与β-arrestins2之间的相互作用。试验检测了4个功能差异(即偶联不同亚型G蛋白)的G蛋白偶联受体：昆虫脂动激素受体(AKHR)、人源烟酸受体(HM74a)、人源大麻受体2(CB2)、人源组胺受体1(H1)的内吞作用，结果所得的已知激动剂或拮抗剂引起相应受体内吞的EC50或IC50值与文献一致，充分证明了该方法的可行性与灵敏性。其方便快速、灵敏定量的特性可进一步用于细胞水平上G蛋白偶联受体的功能筛选，为高通量药物筛选领域注入新的力量。

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致谢

1 综述

1.1 G蛋白偶联受体功能筛选模型的研究进展

1.1.1 G蛋白偶联受体的结构与分类

1.1.2 G蛋白偶联受体的信号途径

1.1.3 G蛋白偶联受体的功能筛选模型

1.1.4总结

1.2内含肽的应用

1.2.1内含肽的性质

1.2.2内含肽的结构与种类

1.2.3内含肽的剪接机理

1.2.4内含肽的应用

1.2.5总结

参考文献

2 Sel-DnaE内含肽的克隆及功能鉴定

2.1实验材料

2.1.1 DNA

2.1.2细胞株

2.1.3试剂

2.1.4培养基及缓冲液

2.1.5试剂盒

2.1.6主要仪器及设备

2.1.7所用数据库及数据分析软件

2.2实验方法

2.2.1 Sel-DnaE内含肽基因的克隆

2.2.2表达载体的构建

2.2.3 Sel-DnaE内含肽自我剪接功能的鉴定

2.3实验结果

2.3.1 Sel-DnaE内含肽基因的克隆

2.3.2表达载体的构建

2.3.3 Sel-DnaE内含肽自我剪接功能的鉴定

2.4讨论

总结

参考文献

3基于DnaE内含肽的定量检测GPCRs内吞方法的建立

3.1实验材料

3.1.1 DNA

3.1.2细胞株

3.1.3试剂

3.1.4培养基及缓冲液

3.1.5试剂盒

3.1.6主要仪器及设备

3.1.7所用数据库及数据分析软件

3.2实验方法

3.2.1构建表达载体

3.2.2细胞培养与质粒转染

3.2.3荧光素酶活性的测定

3.3实验结果

3.3.1定量检测受体内吞模型的设计

3.3.2融合DnaE的受体的功能鉴定

3.3.3定量检测G蛋白偶联受体的内吞

3.3.4定量检测拮抗剂拮抗CB2受体的内吞

3.3.5定量检测G蛋白偶联受体突变体的内吞作用

3.4讨论

4总结

参考文献

附录

作者简历