褪黑激素受体MT1活化的信号转导机制研究及内含肽介导的新型GPCR活化检测模型构建

摘要

G蛋白偶联受体作为细胞膜上最大的一类膜蛋白，在被配体活化后参与了许多重要的生理病理功能。本论文以褪黑激素受体MT1和趋化因子受体CCR5为研究对象，分别对GPCR的信号转导和GPCR的活化检测模型构建两大方面做了基础研究。在针对MT1信号转导的研究中，我们发现MT1除了已报道结合Gi蛋白的同时，也能结合Gs蛋白并引起cAMP/PKA/CREB信号通路的活化。我们探索了MT1结合Gs的分子机制，确定了受体胞内第二环以及跨膜区NSXXNAXXY基序参与了这一结合，并且这一过程可能发生在脂筏这一细胞膜亚结构上。我们进一步探索了MT1同时结合Gs和Gi蛋白在受体失敏内吞和受体活化MAPK/ERK信号通路上的关系，确定了MT1结合Gi蛋白是其内吞的必要条件，并以依赖clathrin的内吞途径进行配体活化后的失敏内吞;MT1介导的MAPK/ERK磷酸化则主要是通过Gi/PI3K/PDK1/PKC途径，此外Gs/cAMP/PKA途径也参与了这一过程。在针对CCR5的活化检测模型构建上，我们以新克隆得到的一条天然断裂的拼接肽selDnaE为基础，实现了包括荧光蛋白和荧光素酶在内的报告蛋白的重组拼接，用以实时监测依赖CCR5活化的细胞融合模型，从而达到筛选拮抗CCR5活化的小分子拮抗剂。这一检测模型的构建为用以抗HIV侵染药物的初筛提供了新的手段。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词

第一章 文献综述

绪言

参考文献

第一节 G蛋白偶联受体活化过程的分子结构特征

1．G蛋白偶联受体存在多个构象

2．G蛋白偶联受体活化后的胞外区(ECL)构象变化

3．G蛋白偶联受体结合配体后跨膜区(TM)构象变化

4．G蛋白偶联受体活化后跨膜区(TM)-胞内区(ICL)构象变化

5．偏好性信号转导

参考文献

第二节 褪黑激素及其细胞膜受体MT1和MT2

1．褪黑激素

2．褪黑激素的结构、代谢和分泌

3．褪黑激素受体

参考文献

第三节 靶向G蛋白偶联受体的药物筛选方法进展

1．通过分析受体配体结合

2．通过分析受体活化和信号转导

3．无需标记的细胞水平检测方法

结语

参考文献

第二章 褪黑激素受体MT1的信号转导机制研究

绪论

参考文献

第一节 MT1结合G蛋白Gs和Gi的分子机制研究

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

参考文献

第二节 褪黑激素受体MT1的内吞途径研究

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 小结与讨论

参考文献

第三节 MT1介导的ERK1／2磷酸化信号通路机制研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 小结与讨论

参考文献

第三章 拼接肽介导的新型GPCR筛选模型的构建

1．引言

2．材料和方法

2．1．材料

2．2．Npu DnaE内含肽和Sel DnaE内含肽的克隆和序列分析

2．3．质粒构建

2．4．细胞培养和转染

2．5．体内反式剪接和重组蛋白的量化

2．6．蛋白免疫印迹

2．7．细胞-细胞融合

3．结果

3．1 断裂型内含肽Sel DnaE基因的克隆和序列分析

3．2 Sel DnaE介导的体内重建

3．3．Sel DnaE内含肽在哺乳动物系统中反式剪接的特异性

3．4．Sel DnaE内含肽介导趋化因子受体CCR5依赖的细胞-细胞融合检测

4．讨论

参考文献

第四章 全文总结

全文总结

本论文的创新点

本论文的不足

发表论文与专利