双生病毒卫星DNA编码的βC1蛋白的生化特性研究

摘要

菜豆金色花叶病毒属病毒(begomoviruses)是一类具有重要经济价值的单链环状DNA植物病毒。近年来,随着B型和Q型烟粉虱迅速在世界各地扩散begomoviruses也急剧全球蔓延。βC1蛋白是单组份begomoviruses相伴随的卫星DNA分子编码的一个具有多种功能的蛋白,包括症状决定因子、RNA沉默抑制子和运动蛋白等。为了进一步弄清βC1蛋白的功能,本论文以中国番茄黄曲叶病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物相伴随的betasatellite编码的βC1蛋白(Y10βC1)为研究对象对它的生理、生化性质等进行了研究。
　　 用原核表达系统表达了Y10βC1蛋白,经Ni-NTA Agrose、凝胶过滤和Heparin亲和层析纯化了Y10βC1重组蛋白。利用凝胶过滤层析和戊二醛介导的化学交联法对Y10βC1的多聚状态进行了体外分析,发现Y10βC1以多聚体的形式存在于溶液中.非还原SDS-PAGE结果表明Y10βC1的多聚化与二硫键无关。以双分子荧互补试验(BiFC)和in vivo化学交联法对Y10βC1的多聚状态进行了体内分析,发现Y10βC1以多聚体的形式存在于本氏烟(Nicotianabenthamiana)细胞质中,但是细胞核中可能以单体或低聚态存在,说明βC1蛋白可能在细胞核和细胞质中采取了不同的构象以执行不同的功能。用PredictProtein等软件对Y10βC1蛋白的二级结构进行了预测,发现Y10βC1包括5个β折叠片和2个α螺旋,其中4个β折叠片位于Y10βC1蛋白的氨基端结构域中,而2个α螺旋和最后1个β折叠片位于Y10βC1蛋白的碳端结构域中碳端结构域中。以Y10βC1蛋白的氨基端结构域和碳端结构域突变体进行BiFC发现Y10βC1的多聚化由碳端结构域中的两个α螺旋介导。PVX侵染实验表明多聚化是Y10βC1蛋白诱导begomovirus类似症状所必须的,同时仅仅多聚化结构域不能诱导产生begomovirus类似症状。生物信息学分析和凝胶过滤层析结果表明多聚化是除有betasatellite编码的βC1蛋白的一个共同特性,并提出了两和可能的多聚化模型。利用电泳迁移率变动试验(EMSA)和核酸酶-交联实验对Y10βC1蛋白的RNA结合特性进行了分析,发现Y10βC1蛋白可以结合单链RNA;农杆菌介导的瞬时表达沉默诱导实验表明Y10βC1蛋白不能抑制dsRNA激发的RNA沉默,这些结果表明Y10βC1蛋白可能通过全新的机制抑制RNA沉默。
　　 最后,利用蛋白质结晶的手段尝试了Y10βC1、氨基端整合麦芽糖结合蛋白(MBP)的βC1(MBP-Y10βC1)、Y10βC1与DNA、Y10βC1与AS1、Y10βC1与AS1与DNA共结晶,且获得了MBP-Y10βC1的晶体并进行了结构的解析,结果表明晶体中只含有MBP蛋白而没有Y10βC1,说明Y10βC1不稳定。此外,获得了AS1与DNA复合体的晶体,但还需要对结晶条件进行进一步的优化以提高晶体的分辨率。
　　 本研兖发现βC1以多聚体形式存在并发挥作用以及可能通过一种全新的机制抑制RNA沉默对进一步揭示βC1蛋白的生物学功能具有重要的价值,并为进一步研究geminiviruses的致病机理打下了基础。