用海洋细菌Pseudoalteromonas tetrodonis QZ-4发酵生产褐藻胶裂解酶的研究

摘要

褐藻胶裂解酶在褐藻胶的生物降解、海藻原生质体制备以及治疗纤维化囊肿等方面有着重要的用途，特别在降解褐藻胶制备多种活性产物方面有着广阔的前景和实际生产意义。本研究分离到了一株新型产褐藻胶裂解酶的海洋细菌P.terodonis.Qz-4；在对其产酶培养基和培养条件进行优化的基础上，建立了分批发酵动力学模型；并探讨了以褐藻胶为底物发酵所得的褐藻胶裂解酶的纯化、酶学性质和酶促反应动力学；建立用粗酶液降解褐藻胶的方法；此外，还初步探讨了褐藻胶酶解糖液对玉米等萌发的影响。主要研究结论如下：
　　 1.在浙江舟山、山东青岛、西班牙等沿海地区采集样品，共采集海水、海藻、泥沙等样品58份，通过平板粗筛得到大量细菌、放线菌、酵母和霉菌，其中具有酶活性的细菌计483株、霉菌计1株；对这484株菌进行平板扩散筛选，结合摇瓶初筛和复筛手段，得到一株生长和产酶(70U/mL)较稳定的海洋细菌。该菌在2.5％NaCl浓度的分离筛选平板上，28℃培养1d，菌落为白色，圆形(φ1mm)，表面湿润光滑，不产色素，革兰氏染色阴性，菌体形态呈短杆状(0.2～0.4μm×0.7～1μm)，单端带鞭毛。通过16S rDNA鉴定，序列G+C含量为52.2％，BLAS工程序比对，该菌株与 Pseudoalteromonas tetrodonis相似性为97％，命名为 Pseudoalteromonasterodonis QZ-4。
　　 2.采用部分因子实验方法和响应面法对P.terodonis QZ-4发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基条件进行优化。首先明确了磷酸氢二铵、氯化钠和硫酸亚铁是影响褐藻胶裂解酶活性的主要因素，进而用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，并采用中心组合设计及响应面分析确定了主要影响因子的最佳浓度，最终获得的优化培养基组成为(g/L)：褐藻酸钠5、磷酸氢二铵11.6、氯化钠32.9、硫酸亚铁0.08、硫酸镁0.3和磷酸氢二钾0.4。通过以上优化后的培养基培养的P.terodonis QZ-4，其褐藻胶裂解酶活力可达到148.24U/mL，与优化前相比，酶活提高了111.8％。
　　 3.研究了不同的表面活性剂对菌体生长和产酶的作用，结果表明Tween80对P.terodonisQZ-4产酶的诱导效果最好，在0.01～0.16％浓度范围内均能促进酶的产生，而Triton x-100、SDS对生长和产酶均有不同程度的抑制作用。
　　 4.采用部分因子实验方法和响应面法对P.terodonis QZ-4发酵生产褐藻胶裂解酶的发酵条件进行优化，结果表明装液量等发酵条件对褐藻胶裂解酶活性有显著的影响；优化后的最佳发酵条件为：发酵温度25℃、转速160rpm、装液量为25mL、发酵时间为15h。理论最大产酶活力为229.40U/mL，实际发酵得到最大产酶活力为256.7U/mL与优化前相比，酶活提高了73.2％，与起始酶活相比，提高了266.7％。
　　 5.在10L发酵罐中研究了以褐藻胶为底物发酵产褐藻胶裂解酶的动力学，并建立了褐藻胶裂解酶的生成动力学模型，底物消耗动力学模型为和菌体生长动力学模型。
　　 6.对褐藻胶裂解酶在PEG/(NH4)2SO4体系中的分配行为进行研究。发现在相同PEG浓度和硫酸铵浓度条件下，分子量范围在2000～6000的PEG，随着分子量的减小，体系的相比逐渐增大，但对酶和总蛋白在双水相体系的分配行为并无显著的影响；随着体系中酶液添加量的增加，分配系数均有所下降。当体系中PEG2000浓度从10％提高到25％时，相比增大，褐藻胶裂解酶的分配系数和萃取率分别从1.75和30.43％增加到10.97和88.76％。当体系中硫酸铵浓度从15％提高到30％时，相比减小，酶的分配系数和萃取率分别从从0.29和11.54％增加到5.14和70.72％。随着体系pH的增加，相比减小，酶的分配系数和回收率略有提高。
　　 7.对纯化后褐藻胶裂解酶的理化性质及反应动力学进行了研究，结果表明：该酶具有同时降解M段和G段的能力，分子量为27 kDa，由L-B作图法求得最大反应速度Vmax=0.541U/mL，米氏常数Km=0.051mg/mL。最适作用pH值和温度分别为7.5和40℃，最适缓冲液为0.05mM Tris-HCl缓冲液，在偏酸或偏碱，以及40℃以上保存则活力快速下降；该酶为金属酶，1.0mol/L EDTA可完全抑制其活性，Mg2+、Na+、Fe3+、Mn2+均对酶活有促进作用，其中以Mg2+的促进作用最为显著，提高50％；Zn2+、A13+、Fe2+、Cu2+均对酶的活力有抑制作用。
　　 8.使用双水相萃取法制备的粗酶液，在35℃、100rpm恒温水浴条件下降解2％藻胶溶液，降解反应15～20h，沸水浴终止反应，通离心和超滤两步分离，得到浓度为1.5～1.6％的酶解糖液。用GPC法分析糖液的分子量分布，以低分子量葡聚糖为标准品，推测制得的酶解寡糖混合液中各组分的聚合度在2～9之间。其中2～6聚合度的寡糖为主要成分，占总量的95.2％；酶解终产物为二糖和三塘，在酶解糖液中的含量分别为32.96％和31.45％。
　　 9.制得的酶解糖液经稀释后，可以作为促种子萌发剂，分别采用种子萌发前浸种和种子萌发后喷洒的方式处理玉米和小麦种子。选用100ppm浓度左右的酶解糖液浸种处理后，玉米和小麦种子的种子生活力均得到提高，小麦的发芽势也得到提高，小麦发芽后的芽长和根数没有明显变化，但是根长有一定增加，根尖活力提高。若选用直接对芽和根喷洒酶解糖液的方式，适用浓度应大幅调低，可选择10ppm浓度左右的酶解糖液，对芽长和根的增加均有促进作用，并避免喷洒浓度500ppm以上的酶解糖液，否则对根的生长和根系活力均有抑制破坏作用。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 褐藻胶多糖的生物学活性研究

1.1.1 褐藻胶多糖的来源和结构

1.1.2 褐藻胶多糖的性质和基本用途

1.1.3 褐藻胶多糖生物生理活性

1.2 褐藻胶低聚糖及其生物学活性的研究

1.2.1 褐藻胶低聚糖的生物学活性

1.2.2 褐藻胶低聚糖制备技术

1.2.3 寡糖的分离纯化方法

1.2.4 寡糖的结构分析技术

1.2.5 褐藻胶寡糖的植物生理功能研究

1.3 褐藻胶裂解酶的研究进展

1.3.1 褐藻胶裂解酶的分类

1.3.2 褐藻胶裂解酶的来源

1.3.3 褐藻胶裂解酶的作用机制

1.3.4 褐藻胶裂解酶的底物专一性

1.3.5 酶活力测定方法

1.3.6 褐藻胶裂解酶基因的克隆与功能鉴定研究

1.3.7 褐藻胶裂解酶的构-效关系研究

1.4 选题依据和达到的预期目标

1.4.1 选题依据

1.4.2 预期目标

1.4.3 研究路线

第二章 褐藻胶裂解酶生产菌的选育

2.0 引言

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 培养基

2.1.3 培养方法

2.1.4 实验方法

2.1.5 实验设计和数据分析

2.2 结果和讨论

2.2.1 酶活测定方法比较

2.2.2 褐藻胶裂解酶产生菌株的筛选

2.2.3 褐藻胶裂解酶产生菌QZ-4的菌种鉴定结果

2.3 结论

第三章 发酵培养基和发酵条件的优化研究

3.0 引言

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 培养基

3.1.3 培养方法

3.1.4 实验方法

3.1.5 实验设计和数据分析

3.2 结果与分析

3.2.1 产酶培养基组分的初步研究

3.2.2 发酵培养基不同组分对褐藻胶裂解酶生产的影响

3.2.3 发酵条件初探

3.2.4 发酵条件优化

3.2.5 优化后发酵过程分析

3.3 结论

第四章 10L罐分批发酵动力学研究

4.0 引言

4.1 材料和方法

4.1.1 材料

4.1.2 培养基

4.1.3 培养方法

4.1.4 分析方法

4.1.5 发酵动力学模型的建立

4.1.6 实验设计与数据分析

4.2 结果与讨论

4.2.1 褐藻胶裂解酶分批发酵过程生长和代谢特性分析

4.2.2 褐藻胶裂解酶分批发酵动力学模型的建立

4.3 结论

第五章 褐藻胶裂解酶的纯化、酶学性质及酶促反应动力学研究

5.0 引言

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 培养基

5.1.3 培养方法

5.1.4 分析方法

5.1.5 酶的分离纯化

5.1.6 酶学性质研究方法

5.2 结果与分析

5.2.1 酶的纯化

5.2.2 基本酶学性质的研究

5.3 结论

第六章 褐藻胶酶解产物对植物源食品种子萌发作用的影响

6.0 引言

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.2 培养基

6.1.3 培养方法

6.1.4 分析方法

6.1.5 寡糖的制备

6.1.6 寡糖促种子萌发作用的实验

6.1.7 实验设计与数据分析

6.2 结果与讨论

6.2.1 酶解寡糖的制备

6.2.2 酶解寡糖促种子萌发作用的研究

6.3 结论

第七章 总结与展望

7.1 总结

7.2 本研究的主要创新点

7.3 后续研究展望

参考文献

致谢