小鼠胚胎干细胞衍生心肌细胞Junctophilin2表征及黄酮类化合物经由蛋白异戊烯化调控分化研究

摘要

胚胎干(embryonic stem, ES)细胞是能在体外自我更新并具有多分化潜能的细胞,可定向分化为功能性心肌细胞,应用于心脏发育生理学、心脏病理学及新药发现等方面研究。Junctophilins(JPs)是近年来发现的一种新型膜连接蛋白家族,心肌细胞仅表达Junctophilin2(JP2)亚型,与维持心肌细胞内Ca2+稳态密切相关;JP2基因突变或表达下降可导致肥大性心肌病和心力衰竭。小鼠ES细胞体外分化为心肌细胞过程能重演体内心肌发育过程表达式,本研究正是利用此模型研究JP2表达功能特征,同时发现异戊烯基黄酮类化合物淫羊藿苷(icariin, ICA)能促进心肌分化过程JP2蛋白表达。本课题组前期研究表明ICA能有效促ES细胞分化为心肌细胞,其促分化活性与黄酮母核及羟基取代密切相关。ICA结构8位存在异戊烯基,推测蛋白异戊烯化可能在心肌分化信号传导中起着重要作用。据此本文率先提出“小G蛋白异戊烯化是心肌分化发育早期分子事件”假说,并通过对合成的8位不同取代基黄酮类同系物促分化活性构效关系研究,探索异戊烯基和蛋白异戊烯化在心肌分化中作用。以期发现并论证心肌分化生命现象早期分子事件和药物作用靶点,为化合物结构设计优化,进一步开发成药物提供药理学依据,最终为心脏病治疗提供新的分子作用靶点和治疗策略。1.小鼠胚胎干细胞衍生心肌细胞JP2表达特征ES细胞体外分化为心肌细胞过程中,JP2表达呈发育依赖性上升。JP2主要表达在肌钙蛋白Troponin-T和肌小节蛋白α-Actinin阳性区域。与JP2共同调控胞内Ca2+平衡的Ca2+调节蛋白Calsequestrin2、Triadin、Caveolin3和RyR2也呈发育依赖性表达,但各自分化中表达时相并不一致,Caveolin3直至分化终末期才出现。siRNA干扰ES细胞JP2基因表达后,中胚层标志,前心肌细胞标志基因表达下调,心肌分化率显著降低,肌小节结构排列杂乱;siRNA干扰ES细胞衍生化心肌细胞后,钙瞬变幅度和频率紊乱,对外Ca2+和咖啡因刺激呈现全无或呈无规律钙瞬变,部分心肌肥大标志基因表达上调;干扰后心肌细胞线粒体膜电位下降,相关基因表达下降,线粒体和内质网结构异常。提示JP2的心肌发育依赖性表达“时间窗”起始于分化早期,JP2表达在心肌发生成熟,胞内Ca2+平衡和线粒体功能维持起着重要作用。2.淫羊藿苷促ES细胞体外心肌分化过程JP2蛋白表达研究ICA能够提前ES细胞心肌分化时相,增多搏动拟配体数目。加入ICA后JP2阳性细胞比例增加,心肌相关蛋白JP2、Troponin-T和a-Actinin表达水平显著提高。提示ICA可以提高分化率并促单个心肌细胞内JP2表达上调。同时,ICA能够提高ES细胞衍生心肌细胞内Ca2+瞬变活跃程度及心肌细胞对咖啡因和外Ca2+刺激敏感性,增强心肌细胞的收缩能力。这表明ICA促心肌分化作用可能通过提高分化率和增强心肌细胞功能两方面进行。3.黄酮类化合物经由蛋白异戊烯化调控心肌分化研究通过稳定转染Anf启动子的P19细胞荧光筛选体系和ES细胞心肌分化模型评价,8位具异戊烯基的3’b促ES细胞心肌分化能力相对较强。异戊烯基转移酶GGTase抑制剂能显著抑制各化合物促心肌相关蛋白表达作用,并抑制下游p38和ERK磷酸化水平及PI3K下游GSK3β表达。而异戊烯基转移酶FTase抑制剂则未能显著抑制上述化合物促心肌相关蛋白表达,但能拮抗各化合物提高p38磷酸化作用,并使ERK磷酸化水平上调。P3IK特异性抑制剂能拮抗各化合物促心肌相关蛋白表达及提高p38磷酸化和GSK3β表达作用,提高各化合物促ERK磷酸化作用。进一步研究发现ICA能显著提高Racl和PI3K基因表达,并能部分拮抗P3IK特异性抑制剂作用。提示ES细胞分化为心肌细胞过程GGTase介导蛋白质异戊烯化起主导作用,其作用效应可能部分依赖Ras-PI3K-MAPKs信号通路。

目录

致谢

前言

中文摘要

Abstract

论文创新点

缩写、符号清单、术语表

第一部分ES细胞体外分化为心肌细胞过程JP2蛋白表达规律和功能特征

引言

1 试剂与器材

1.1 实验动物及细胞株

1.2 主要试剂

1.3 实验仪器和器材

1.4 小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞用溶液

2 实验方法

2.1 小鼠ES细胞体外分化为心肌细胞步骤

2.2 RT-PCR法检测JP1,2基因表达

2.3 免疫细胞荧光成像检测JP1,2和钙离子调节蛋白

2.4 流式细胞术检测JP2、Troponin-T和α-Actinin表达

2.5 Western blot法检测JP2等相关蛋白表达

2.6 Percoll不连续密度梯度离心法分离ES细胞衍生心肌细胞

2.7 siJp2干扰ES细胞或ES细胞衍生心肌细胞

2.8 JC-1染色检测线粒体膜电位

2.9 胞浆钙离子浓度测定

2.10 扫描电镜生物样品制备

2.11 统计处理

3 实验结果

3.1 ES细胞培养及体外分化为心肌细胞

3.2 免疫荧光成像原位检测ES细胞分化心肌中JP1,2表达

3.3 ES细胞心肌分化过程Jp1,2基因蛋白检测

3.4 流式细胞术定量检测ES细胞分化心肌细胞中JP2表达

3.5 免疫荧光成像原位检测ES细胞分化心肌中钙调控蛋白表达

3.6 ES细胞心肌分化过程钙调控蛋白表达

3.7 siJp2干扰ES细胞后对心肌分化搏动率影响

3.8 siJp2干扰ES细胞对胚层发育及前心肌细胞等标记基因影响

3.9 免疫荧光成像检测siJp2干扰ES细胞对心肌相关蛋白表达影响

3.10 siJp2干扰ES细胞衍生心肌细胞及干扰结果检测

3.11 siJp2干扰ES细胞分化心肌细胞对心肌肥大及相关基因影响

3.12 siJp2干扰ES细胞衍生心肌细胞后胞内Ca~(2+)水平检测

3.13 siJp2干扰衍生心肌细胞对线粒体膜电位和相关细胞器影响

4 讨论

5 结论

第二部分淫羊藿苷促ES细胞体外心肌分化过程JP2蛋白表达研究

引言

1 试剂与器材

1.1 实验动物及细胞株

1.2 主要试剂

1.3 实验仪器和器材

1.4 小鼠ES细胞分化为心肌细胞用溶液

2 实验方法

2.1 小鼠ES细胞体外分化为心肌细胞

2.2 免疫荧光成像原位检测JP2表达

2.3 流式细胞术检测JP2和α-Actinin表达

2.4 Western blot法检测Troponin-T,JP2和α-Actinin蛋白表达

2.5 Percoll不连续密度梯度离心法分离ES细胞衍生心肌细胞

2.6 统计处理

3 实验结果

3.1 显微镜下统计EB搏动率评价ICA促心肌细胞分化效果

3.2 免疫荧光成像原位检测心肌分化中ICA对JP2表达影响

3.3 Western blot法检测心肌分化中ICA对心肌相关蛋白表达影响

3.4 流式细胞术定量检测心肌分化中ICA对JP2和α-Actinin影响

3.5 Western blot法检测ICA对纯化心肌细胞中相关蛋白表达影响

3.6 流式细胞术定量检测ICA对纯化心肌细胞中JP2等蛋白表达影响

3.7 胞浆钙离子浓度测定评价ICA对分化心肌细胞功能影响

4 讨论

5 结论

第三部分 黄酮类化合物经由蛋白异戊烯化调控ES细胞分化心肌细胞机制

引言

1 试剂与器材

1.1 实验动物及细胞株

1.2 主要试剂

1.3 实验仪器和器材

1.4 小鼠ES细胞分化为心肌细胞用溶液

2 实验方法

2.1 小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞步骤

2.2 RT-PCR法检测Racl和PI3K基因表达

2.3 免疫荧光成像原位检测α-Actinin表达

2.4 Western blot法检测Troponin-T,JP2和α-Actinin蛋白表达

2.5 荧光显微镜检测EBs内ROS水平

2.6 统计处理

3 实验结果

3.1 组合化学小分子化合物库内黄酮类化合物初级筛选

3.2 ES细胞心肌分化模型次级筛选库内黄酮类化合物

3.3 异戊烯基转移酶抑制剂GGTI-298对ES细胞心肌分化影响

3.4 GGTI-298对心肌相关蛋白表达及MAPK通路影响

3.5 FTI-277对心肌相关蛋白表达及MAPK通路影响

3.6 PI3K抑制剂LY294002对心肌相关蛋白表达及MAPK通路影响

3.7 ICA对异戊烯化相关靶点Rac1和PI3K表达影响

3.8 Western blot法检测GGTI-298对PI3K通路影响

3.9 Western blot法检测FTI-277对PI3K通路影响

3.10 Western blot法检测LY294002对PI3K通路影响

3.11 荧光显微镜检测加药后EBs内ROS水平

4 讨论

5 结论

参考文献

文献综述:Junctophilin-2生物学特征及研究进展

参考文献

附录1:大鼠心脏胚胎发育过程JP1,2基因蛋白表达检测

附录2:P19畸胎瘤细胞转染及体外培养和分化成心肌细胞

作者简历及在学期间取得奖项与科研成果