乳腺癌相关成纤维细胞Caveolin-1的表达及临床意义

摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,约占女性全部恶性肿瘤的22％。中国虽属乳腺癌的低发地区,但近年来发病率也呈现迅速增高趋势,位于我国女性恶性肿瘤的第二位。治疗乳腺癌的方法也取得很大进展,如化疗、放疗、内分泌疗法和免疫疗法等,但大多数研究及治疗方向均集中于乳腺癌实质细胞,对于间质微环境在乳腺癌发生、发展与转移中的作用,以及将间质成分作为抗乳腺癌治疗的新靶标,仍有待于更深入研究。
　　 癌细胞周围的间质微环境不同于正常的间质微环境:1)细胞外基质(ECM)成分发生改变；2)微血管密度的增加；3)炎症细胞的浸润和大量激活的成纤维细胞增生。这些激活的成纤维细胞,被称为癌相关成纤维细胞(cancer-associatedfibroblasts,CAFs)。在损伤或炎症性病变中,往往伴有纤维形成性反应,也出现增生的肌纤维母细胞,相对于CAFs,被称为正常肌纤维母细胞(Normalfibroblasts,NFs)。CAFs与NFs都是肌纤维母细胞,兼有成纤维细胞和平滑肌细胞的特性。在普通光学显微镜下观察无法区分肌纤维母细胞与未活化的成纤维细胞,但肌纤维母细胞具有特征性的超微结构:胞浆中含有丰富的粗面内质网、肌丝和致密斑、应力纤维,细胞膜上有纤维连接复合体等。
　　 CAFs在肿瘤的发展过程中的作用在不同的研究者得到完全相反的结论:CAFs对恶性上皮细胞的侵袭具有防御性屏障作用或促进侵袭作用。目前更多研究认为,CAFs与恶性上皮细胞协同作用促进肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。因此,对肿瘤微环境中CAFs进行深入研究更有助于理解肿瘤发生机制以及浸润、转移等生物学行为,以及发现新的治疗靶点。现有的一些研究已经表明,以CAFs为靶标进行抗肿瘤治疗具有良好的应用前景,已认识的主要机制是:1.CAFs是微环境中的最主要的间质细胞,可产生ECM(如Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原与纤维连接蛋白)和组织蛋白酶,以及大量的细胞因子、黏附分子,对于维持微环境的稳定起重要作用；2.未活化的成纤维细胞可以抑制它周围上皮细胞发生恶变,并能使癌变的细胞转分化为正常上皮细胞；3.未活化的成纤维细胞活化成为CAFs后,可以促进肿瘤形成及影响肿瘤细胞侵袭和转移的模式。通常是以α-SMA,vimentin,FAP做为肌纤维母细胞分类和识别的标志,CAFs与非癌组织内的NFs虽然都是肌纤维母细胞,但功能不同,存在表达差异性蛋白,CAFs可能正是因为表达此类不同于NFs的差异性蛋白,对肿瘤细胞产生促进或抑制侵袭与转移的作用。关于NFs与CAFs间表达差异性蛋白及其在临床研究中应用的相关报道,尚不多见。最近有研究表明,小窝蛋白(Caveolin-1,Cav-1)可做为CAFs的新的标记物,检测它在肿瘤的间质内表达对评估预后更有提示意义,而不是在上皮细胞的表达。但是,Cav-1在乳腺癌间质内CAFs的表达状况与临床参数的相关性仍不明确,本研究旨在检测Cav-1在乳腺癌的间质内CAFs上的表达水平及临床病理指标和分子分型的相关性,并探索建立以间质中Cav-1的表达水平作为指标的乳腺癌危险度分层模型,对评估乳腺癌的预后提供有价值的新指标。
　　 研究分以下三部分进行:
　　 第一部分肌纤维母细胞和癌相关成纤维细胞的蛋白表达差异性研究。
　　 材料与方法：
　　 选取2000年-2009年伴有肌纤维母细胞增生的病例共73例,分为癌与非癌组。癌组病例占54.8％(40／73),包括食管癌、胃癌、胰腺癌,结直肠癌,乳腺癌等病变,非癌组病例占45.2％(33／73),包括鼻息肉,慢性胆囊炎,输卵管炎和纤维腺瘤等病变。分别检测六个肿瘤间质表达蛋白:基质细胞衍生因子(stromalcell-derived factor-1,SDF-1)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein,acidic and rich in cysteine,SPARC)、小窝蛋白1(Caveolin-1,Cav-1)、成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)、腱糖蛋白C(Tenascin C,TNC)和成骨细胞特异性因子2(Osteoblast-specific factor2,OSF-2)的表达,分析非癌组与癌间质内具有显著差异性的蛋白分子表达。以平滑肌肌动蛋白(smooth-muscle actin,α-SMA)及血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor—β receptor,PDGFR-β)做为鉴定肌纤维母细胞的特异性标记物。
　　 结果：
　　 Cav-1在间质内表达的阳性率,癌组为85.0％(34／40)高于非癌组45.5％(15／33),癌组表达水平显著高于非癌组,具有统计学意义(p<0.05)。SPARC和TNC在癌组与非癌组阳性率均达到100％,只是阳性程度有差异性。在非癌组间质内表达更广泛,阳性程度更高,分为高表达与低表达组后,非癌组内间质的表达水平显著高于癌组,且差异具有统计学意义(p<0.05)。六个检测指标中仅有Cav-1与CAFs标记物α-SMA的阳性表达部位最为相似。
　　 结论：
　　 1、Cav-1在CAFs中呈高表达,SPARC和TNC呈相对低表达,提示在癌组织中CAFs在蛋白质表达水平上不同于良性病变中的肌纤维母细胞。
　　 2、Cav-1癌组表达水平显著高于非癌组,且与CAFs标记物α-SMA的阳性表达部位最为相似,提示可作为CAFs的定性辅助检测指标。
　　 第二部分乳腺癌相关成纤维细胞Caveolin-1的表达状况及临床意义。
　　 材料与方法：
　　 应用免疫组化技术EnVision法,检测Cav-1在143例乳腺癌间质CAFs中的表达状况,分析其与临床病理指标的相关性及预后分析。
　　 结果：
　　 Cav-1在乳腺癌间质内表达状况与α-SMA阳性表达水平接近,经秩和检验两者间无差别,表明Cav-1可作为乳腺癌CAFs的标志物。间质Cav-1的表达阳性率在浸润性乳腺癌为65.7％(94／143)显著高于乳腺导管原位癌0％(0／10)和正常乳腺组织0％((0／10)(均P=0.000)；Cav-1在浸润性乳腺癌间质CAFs的阳性率在浸润性导管癌和混合性癌分别为74.1％(70／105)和78.9％(15／19)显著高于浸润性小叶癌47.3％(9／19)(均P＝0.000)；间质Cav-1表达水平与ER状态正相关(Spearman相关系数为0.218),差异有统计学意义(P=0.046)；间质内Cav-1的表达水平与组织学分级呈负相关性(Spearman相关系数为-0.052),差异有统计学意义(P=0.008)；乳腺癌各分子亚型中间质内Cav-1阳性率分别为:管腔A型71.4％(25／35),管腔B型74.2％(23／31),HER2阳性型66.7％(24／36)和基底细胞样型11.1％(1／9),其中只有管腔B型阳性率显著高于基底细胞样型(P＝0.048)。Log-rank检验表明患者年龄(P=0.000)、淋巴结转移状况(P=0.042),TNM分期(P＝0.027),组织学分级(P＝0.017)和Cav-1间质表达状况(P=0.029)与患者5年生存率明显相关；COX回归模型分析显示Cav-1间质表达状况是乳腺癌的独立预后因素(P=0.009)。
　　 结论：
　　 1、Cav-1在间质CAFs的表达水平与乳腺癌的组织学类型、组织学分级和ER状况相关。
　　 2、Cav-1在间质CAFs的表达水平与乳腺癌的预后相关,Cav-1在乳腺癌间质内CAFs的低表达提示乳腺癌患者的预后不良。
　　 第三部分 Caveolin-1在乳腺癌相关成纤维细胞中的表达水平与乳腺癌分子亚型的相关性
　　 材料与方法：
　　 应用免疫组织化学法EnVision法,检测168例乳腺癌的Cav-1在CAFs的表达状况。用荧光原位杂交(FISH)检测乳腺癌的HER2基因扩增状态。分析乳腺癌各分子亚型及HER2蛋白水平和基因扩增状况与间质内Cav-1表达情况的相关性。
　　 结果：
　　 Cav-1在乳腺癌内CAFs表达水平与病理学分子亚型有关,Cav-1在各分子亚型中的间质表达中,HER2+型和Luminal B型阳性表达率分别为83.3％(35／42),83.3％(20／24),显著高于Luminal A型57.4％(35／61)与Basal-like型38.8％(7／18),且差异有统计学意义(P<0.05)。间质内Cav-1表达与HER2蛋白水平呈正相关,随着HER2蛋白表达水平的增高间质Cav-1表达水平也增高。间质内Cav-1阳性率在HER2基因扩增组为81.8％(54／66)高于未扩增组55.9％(57／102),统计学差异均有显著性(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1、乳腺癌分子亚型中,CAFs的Cav-1表达水平与病理学分子亚型相关,HER2+型和Luminal B型组显著高于Luminal A型和Basal—like型组。
　　 2、乳腺癌间质内CAFs的Cav-1表达水平与HER2蛋白水平及HER2基因扩增呈正相关。