ε-聚赖氨酸高产菌株的选育及发酵生产的研究

摘要

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是一种含有25-30个赖氨酸残基的同型单体聚合物多肽，由赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接而成，是一种具有抑菌功效的多肽。ε-PL抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果．此外，ε-PL安全性高，能在人体内分解为赖氨酸，是一种营养型抑菌剂。ε-PL已于2003年10月被FDA批准为安全食品保鲜剂，被广泛应用于食品保鲜．但是，目前ε-PL采用的是微生物发酵生产方法，产量低，造成生产成本提高、价格昂贵，很大程度上限制了ε-PL的工业化生产和推广使用．
　　 本论文旨在筛选出ε-PL高产菌株，通过培养基及发酵条件优化、诱变选育等方法提高ε-PL的产量，确定发酵液中分离提纯ε-PL及小试生产的工艺条件，同时探讨ε-PL细胞外合成的方法．
　　 主要研究结果如下：
　　 (1)优化了从土壤中分离放线菌的方法及分离程序，并建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量筛选方法，结果表明，土样经CaCO3处理后，过100目筛，取59土样50℃烘1h，加入50 mL5 mM磷酸缓冲液(pH7.0，蛋白胨6％和SDS0.05％)．50℃，150rpm振荡培养1Omin;稀释适当浓度后，涂布于含有0.005％K2Cr2O7的筛选培养基上，明显抑制了细菌的生长，有利于放线菌的分离．同时，通过在培养基中添加0.002％亚甲基蓝，初步筛选到了176株产碱菌株；利用Dragendorff试剂检测得到49株产碱菌株；复筛得到7株ε-PL产量较高的ε-PL产生菌，其中菌株157的产量最高，为0.201g/L。
　　 通过对菌株157进行形态特征、培养特征、生理生化特征等初步鉴定后，确定为链霉菌属，采用Sherlock全自动微生物鉴定和分子生物学鉴定，对其16SrDNA全系列的相似性比较和系统发育分析，结果表明，菌株157与链霉菌属内的娄彻氏链霉菌（S.rochei）同源性最高为100％，但与链霉菌属内多个种同源性均在97％以上，不能准确鉴定到种，因此，鉴定结论为链霉菌属，将其标记为S.sp.157。
　　 (2)对菌株S.sp.157进行了培养基成分碳源、氮源的筛选，结果表明，葡萄糖、蛋白胨、(NH4)2SO4分别为最佳碳源、有机氮源、无机氮源。单独使用有机氮源或无机氮源均不能产生ε-PL，(NH4)2SO4和蛋白胨共同使用，才有利于ε-PL的积累。
　　 通过采用Box-Behnken试验设计，运用响应面分析方法，对影响发酵产量的三个主要因素进行了优化，最终确定了最佳培养基的组成为(g/L)：葡萄糖，62.49;蛋白胨，5.71;(NH4)2SO4,11.19; MgSO4,0.5; FeSO4,0.03; ZnSO4,0.04;KH2PO4，1.36; Na2HPO4.12H2O，3.58，pH6.8．使用此培养基，ε-PL产量为0.349±0.025 mg/mL，比初始培养基提高了1.75倍．
　　 运用单因素试验方法研究了无机盐对菌株ε-PL产量的影响，结果表明，MgSO4的最佳浓度为0.1％，而FeSO4、ZnSO4对ε-PL产量的影响不明显。
　　 研究了发酵培养条件对菌株ε-PL发酵的影响，结果表明，最佳培养条件为：装液量100 mL/500 mL三角瓶，初始pH7.0，接种量3％，发酵温度30℃。
　　 (3)研究了菌株诱变后定向筛选出正向突变株的条件，即选用AEC和甘氨酸作为抗性筛选剂进行定向筛选，菌株S.sp.157、S.albulus的诱变筛选抗性临界浓度( AECr+Glyr)分别为7 mg/mL+6 mg/mL、9 mg/mL+6 mg/mL。
　　 分别采用紫外线诱变、DES化学诱变、60Coγ射线辐照诱变、常压室温等离子体( ARTP)诱变等多种方法对菌株S.sp.157、S.albulus进行高产菌株诱变选育。结果表明，紫外线诱交、DES化学诱变、ARTP诱交后均得到了较高ε-PL产量的诱变菌株，其中有4株变异株的ε-PL产量明显提高，分别为S.sp.157 UV1、S.albulus UV5、S.albulus A29、S.albulus A30，进行五次传代培养后，ε-PL的产率均没有出现波动，分别是出发菌株的2.3、2.9、3.8、3.6倍，遗传稳定性良好。而60Coγ射线辐照诱变的效果不理想，该方法不适用于菌株S.sp.157、S.albulus的诱变选育。
　　 (4)在摇瓶发酵的基础上，对突变株S.albulus A29进行上罐发酵，采用5L发酵罐，进行了ε-PL小试生产的研究．结果表明，要提高ε-PL的产量，必须采取合适的策略，即：在第一阶段，充分创造生长条件（如补料），使菌体量达到最高，为后续ε-PL的合成奠定基础；在第二阶段，延长ε-PL生成的时间，同时保持菌种能够持续生长（如调控pH）。
　　 采用pH调控及补料的策略对发酵进行研究，实验结果表明，pH调控及适时补料(甘油：(NH4)2SO4=5:1），使菌种在发酵过程中菌体生长期延长，ε-PL产量持续增加，ε-PL产量为8.92 g/L，是未调控的发酵体系的5.8倍。
　　 (5)确立了从发酵液中分离提纯ε-PL的工艺。
　　 发酵液经过离心分离、等电点沉淀蛋白（调pH7.0）、超滤（5K聚砜超滤膜）之后，达到了去除发酵液中不溶性固形物及部分杂蛋白的效果。
　　 采用三种不同的树脂分别进行离子交换吸附，实验结果表明，弱酸型阳离子交换树脂HD-2对ε-PL的吸附及解吸效果最好，当层析柱为22mm×300mm时，吸附及解吸条件为：上样流速为3mL/min，洗脱剂为O.1mol/L的HCl，洗脱流速为3mL/min，此分离提纯工艺条件下ε-PL的回收率为92.0％．
　　 将通过弱酸型阳离子交换树脂HD-2的解吸液进行脱色，浓缩后，真空冷冻干燥，得到粗品，经Tricine-SDS-PAGE电泳及高效液相检测后，可确定为ε-PL粗品。
　　 (6)确立了HPLC法检测ε-PL的方法；初步探讨了ε-PL细胞外合成的反应体系，结果表明，菌体细胞经过超声波破碎后，高速离心后获得细胞粗酶液，以粗酶液，L-1ysine、ATP、Mg2+等为反应底物，成功建立了10mL反应体系，经HPLC、MALDI-TOF-MS检测确定体系中有ε-PL生成，浓度为0.582 mg/mL．

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章 文献综述

1 天然防腐剂

2 徼生物源天然防腐剂

2.1 微生物源天然防腐剂的种类

2.2 微生物源天然防腐剂的应用

3 ε-聚赖氨酸

3.1 理化性质

3.2 ε-PL的抑茵活性

3.3 ε-PL的抑菌机理

3.4 ε-PL的微生物合成

3.5 ε-PL的应用

4 课题研究的意义及目的内容

4.1 研究背景及意义

4.2 研究目的及内容

第二章 E-PL产生菌的筛选及菌种鉴定

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果与讨论

3.1 土壤中放线菌分离方法的建立

3.2 ε-PL产生茵的筛选

3.3 菌株157的鉴定

4 本章小结

第三章 产E-PL菌株S.sp.157培养基及发酵条件的优化

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

3 结果与讨论

3.1 菌株S.sp.157生长曲线的测定

3.2 最佳碳源的筛选

3.3 最佳氮源的筛选

3.4 Box-Behnken设计组合优化

3.5 无机盐对ε-PL发酵的影响

3.6 发酵条件的优化

4 本章小结

第四章 E-PL高产菌株的诱变选育

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果与讨论

3.1 诱变致死率曲线

3.2 AEC和甘氨酸浓度的确定

3.3 突变株初筛、复筛结果

3.4 遗传稳定性研究

4 本章小结

第五章 5L发酵罐中E-PL发酵的研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 实验方法

3 结果与讨论

3.1 突变株S.albulus A29的生长曲线

3.2 分批发酵

3.3 pH控制下的补料发酵

4 本章小结

第六章 发酵液中E-PL的分离提纯

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 实验方法

3 结果与讨论

3.1 发酵液的预处理

3.2 离子交换树脂对ε-PL的静态吸附及解吸

3.3 弱酸型HD-2树脂的最大吸附量

3.4 不同浓度盐酸解吸效果的测定

3.5 HD-2型树脂的动态吸附及解吸条件的确立

3.6 ε-PL粗品制备及验证试验

4 本章小结

第七章 E-PL的细胞外生物合成

1 引言

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 实验方法

3 结果与讨论

3.1 利用高效液相色谱检测ε-PL方法的确立

3.2 粗酶液的提取

3.3 反应体系的建立

3.4 反应产物ε-PL的检测

4 本章小结

第八章 研究总结及展望

1 主要结果

2 创新点

3 后续研究展望

参考文献

作者简介

博士期问成果