固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究

摘要

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，简称GABA）是哺乳动物神经系统的一种神经递质抑制剂，对人体具有镇静安神、促进睡眠、改善免疫功能等作用，在食品和医药领域具有广泛的应用价值，由生物方法制备的GABA已被我国卫生部列为“新资源食品”。生物体内的GABA由谷氨酸脱羧酶（glutamatede carboxylase，简称GAD）催化谷氨酸脱羧生成，因此GAD是GABA生物制备的关键酶。为了提高GABA生物制备方法的效率和竞争力，本文以利用固定化GAD进行GABA的生物制备为目标，分别采用凝胶包埋法和金属螯合方法进行了GAD的固定化，考察了固定化条件对固定化酶性能的影响，优化了固定化条件，测定了所得固定化酶的底物亲和强度、最适催化条件和操作稳定性等关键性质，为利用固定化GAD进行GABA的生物制备创造了条件。具体研究内容如下：
　　 对聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，简称PVA）-海藻酸钠（sodium alginate，简称SA）固定化GAD的条件进行了研究。分别考察了PVA浓度和SA浓度对凝胶颗粒直径、机械强度以及固定化后酶活力保留的影响；PVA和SA比例对固定化后酶活力保留的影响；PVA-SA与GAD酶液比例对固定化酶催化活力和酶活回收率的影响；以及CaCl2浓度对固定化后GAD酶活力的影响。研究表明，当PVA浓度为9％，SA浓度为2.5%，PVA:SA(W/W)为70:30，PVA-SA:GAD(W/V)为6：1，CaCl2浓度为1%时能获得机械强度好，酶活回收率最高的固定化GAD凝胶颗粒。在上述优化的条件下，考察了固定化GAD的各项酶学性质,并与游离酶加以比较。同时，测定了固定化后GAD的表观动力学参数，评估了PVA-SA包埋法固定化GAD的操作稳定性。研究表明，GAD的最适催化温度与游离酶相同为50C;最适催化pH向碱性方向略有改变为pH4.8;热稳定性最强的温度为45℃，比游离酶高了10C;酸碱稳定性最好的pH为5.2，在实验设定的pH范围内，固定化GAD的稳定性大大高于游离酶；Km为13.6mmol/L;连续催化7次以后，固定化GAD酶活力仍然保持在初始值的87%左右，说明PVA-SA法制备的固定化GAD凝胶颗粒操作稳定性好，具有很好的应用前景。
　　 利用亲和层析介质Ni-NTA对GAD进行了固定化，并测定了固定化后的各项酶学性质，动力学参数，考察了其操作稳定性。Ni-NTA亲和固定化GAD的最佳投料浓度为0.6mg/mL;最适催化温度与游离酶相同为50℃；最适pH向碱性方向略有改变为pH4.8;酸碱稳定性最强的pH为5.6，热稳定性最好的温度为35℃；Km值为34.4mmol/L;重复使用8次后，活力保持初始活力的75%。