内切型-β-葡聚糖酶基因的克隆与表达

摘要

内切型-β-葡聚糖酶(endo-β-glucanase，EG)是纤维素酶的重要组分之一，在纤维素水解、棉织物生物整理、饲料、造纸等领域中应用广泛。本文对内切型-β-葡聚糖酶基因的克隆及其在原核细胞、毕赤酵母和丝状真菌中的表达进行了系统研究。
　　将厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶的基因celE与表达载体pET-28a(+)重组后，转入大肠杆菌BL21(DE3)。采用SDS-PAGE蛋白电泳对重组大肠杆菌表达产物进行分析，在42 kDa附近得到了与目的蛋白催化区域理论值相当的蛋白条带。酶学性质研究表明，酶蛋白的最适作用条件为pH6.0，45℃。摇瓶条件下重组大肠杆菌的EG活力可达到39.1 IU ml-1。
　　将celE基因与含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的表达载体pPIC9K重组，采用基因导入仪将线性化后的重组DNA导入毕赤酵母GS115，筛选得到3株高G418抗性的转化子。经PCR鉴定表明:celE基因已整合到毕赤酵母的基因组上，这一特点有利于保持遗传性状的稳定。在摇瓶培养条件下，以1.0％的甲醇为碳源和诱导物，96h发酵液中EG活力可达74.1 IU ml-1。
　　以根瘤农杆菌AGL-1为介导，对里氏木霉(Trichoderma reesei) ZU-02分生孢子体系的DNA转化技术进行了研究。构建了含里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ强启动子Pcel7a（及其信号肽）和终止子Tcel7a以及潮霉素B抗性标记的新型重组质粒pCB-hPsT，该质粒适用于将目的基因导入里氏木霉中并实现分泌表达，为外源基因在丝状真菌中的克隆与高效表达提供了一个新的技术平台。对农杆菌介导的转化条件进行了研究，发现孢子的预萌发处理对转化效率的提高有重要作用，当萌发时间从0h提升到3h，转化效率可提高25倍以上。该研究结果对于进一步完善丝状真菌基因导入技术平台具有重要意义。
　　采用生物信息学技术分析了厌氧真菌基因和里氏木霉基因之间的序列差异，依据里氏木霉的密码子偏好对celE序列的催化区域进行了优化，得到新基因序列celEn。采用pCB-hPsT农杆菌介导载体，分别构建含有原始催化区域celE*和优化催化区域celEn的重组质粒pCB-hE*和pCB-hEn。采用农杆菌介导技术将目的基因导入到里氏木霉中，分别获得了300株重组菌株T.reesei/pCB-hE*和293株重组菌株T.reesei/pCB-hEn，后者在以CMC为唯一碳源的平板上生长明显加快，并筛选到8株高产CelEn的重组里氏木霉T.reesei/pCB-hEn。在摇瓶条件下发酵84h时EG活力最高可达193.6 IU ml-1(pH6.0)，约是出发菌株同期EG酶活的6.0倍。该研究成功实现了厌氧真菌的内切型-β-葡聚糖酶基因在好氧真菌里氏木霉中的分泌表达，所获得的纤维素酶在牛仔织物水洗整理中具有重要的应用价值，该项研究成果填补了国内中性纤维素酶的生产空白。
　　采用pCB-hPsT农杆菌介导载体，将里氏木霉的内切型-β-葡聚糖酶基因cel5a置于强启动子Pcel7a和终止子Tcel7a之间，进一步导入并整合到T.reesei ZU-02的基因组DNA上，在以CMC为唯一碳源的选择性平板上筛选到4株生长速率最快的重组子。这4株高产重组子在摇瓶发酵条件下产酶120h可达297.1IUml-1(pH4.8)，约是出发菌株ZU-02同期酶活的3.9倍，同时滤纸酶活约提高30％-40％。该项研究成果对于纤维素酶定向进化和高分解活性的纤维素酶生产菌株的构建具促进作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 纤维素酶概述

1．2．1 纤维素酶的结构

1．2．2 纤维素酶的作用机制

1．3 内切型-β-葡聚糖酶基因的克隆与表达

1．3．1 在原核细胞中的克隆与表达

1．3．2 在酵母细胞中的表达

1．3．3 在丝状真菌中的表达

1．4 内切型-β-葡聚糖酶的主要应用

1．4．1 在纺织工业中的应用

1．4．2 在造纸工业中的应用

1．4．3 在啤酒工业中的应用

1．4．4 在饲料工业中的应用

1．5 根瘤农杆菌介导转化丝状真菌的研究

1．4．1 ATMT技术的原理

1．4．2 影响转化效率的因素

1．4．3 根瘤农杆菌介导转化的应用

1．6 本工作的研究思路及拟研究内容

第二章 厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 培养基

2．2．3 实验仪器

2．2．4 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 重组质粒pET28a(+)-celE的构建

2．3．2 重组质粒的验证分析

2．3．3 SDS-PAGE检测蛋白产物的表达

2．3．4 内切型-β-葡聚糖酶最适作用条件

2．3．5 重组大肠杆菌诱导表达条件的优化

2．4 小结

第三章 厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 培养基

3．2．3 实验仪器

3．2．4 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 毕赤酵母表达载体的构建及质粒验证

3．3．2 毕赤酵母的转化及高抗G418转化子的筛选

3．3．3 高抗G418重组子基因组PCR验证

3．3．4 重组子表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳

3．3．5 重组毕赤酵母对CMC的利用

3．3．6 重组酶的最适作用条件研究

3．3．7 诱导剂甲醇添加浓度的研究

3．3．8 重组毕赤酵母的产酶进程

3．4 小结

第四章 根瘤农杆菌介导里氏木霉高效转化体系的构建

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 培养基

4．2．4 主要仪器

4．2．5 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 重组质粒pCB-hPsT的构建

4．3．2 抗生素筛选浓度的确定

4．3．3 IM共培养基pH对转化效率的影响

4．3．4 共培养温度对转化效率的影响

4．3．5 乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响

4．3．6 农杆菌浓度对转化效率的影响

4．3．7 孢子预萌发时间对转化效率的影响

4．3．8 里氏木霉转化子的传代稳定性

4．4 小结

第五章 厌氧真菌内切型-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的表达

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 材料和试剂

5．2．2 实验仪器

5．2．3 培养基

5．2．4 实验方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 催化区域的扩增

5．3．2 催化区域的密码子优化

5．3．3 介导转化载体的构建

5．3．4 里氏木霉转化子平板筛选

5．3．5 新序列celEn在里氏木霉宿主中的表达

5．3．6 里氏木霉转化子T．reesei／En的摇瓶产酶筛选

5．3．7 高产CelEn重组子的摇瓶发酵时间进程

5．3．8 高产CelEn重组子所产EG的酶学性质

5．4 小结

第六章 里氏木霉内切型-β-葡聚糖酶基因的同源表达

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 材料和试剂

6．2．2 实验仪器

6．2．3 培养基

6．2．4 实验方法

6．3 结果与讨论

6．3．1 里氏木霉内切型-β-葡聚糖酶基因cel5a的PCR合成

6．3．2 介导转化载体pCB-h5A的构建

6．3．3 同源表达转化子的平板筛选

6．3．4 SDS-PAGE检测蛋白胞外表达

6．3．5 里氏木霉转化子T．reesei／5An的摇瓶产酶筛选

6．3．6 高产Cel5A重组子的摇瓶发酵时间进程

6．3．7 高产Cel5A重组子所产EG的pH适用范围

6．3．8 高产CelEn／Cel5A重组子产酶特性比较

6．4 小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 论文创新点

7．3 展望

参考文献

作者简历