弓形虫MAG1蛋白的原核表达及ELISA检测方法的建立

摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)呈全球性分布，专性细胞内寄生，能导致人兽共患的弓形虫病。弓形虫感染可引发很多顽症如脑病和眼病等，引起母畜流产、死胎，并可对免疫缺陷动物产生致死效果，对畜牧业危害比较严重。
　　 MAG1是一种位于组织包囊基质部位的蛋白，由于只能在缓殖子阶段的包囊的提取物中被检测到，而不能通过免疫印迹在速殖子内检测到，曾一度被认定为是缓殖子阶段特异表达的蛋白。后来一些学者发现MAG1也能在包裹速殖子的纳虫泡内被检测到，RT-PCR方法和微阵列实验的结果也支持了这种观点。很多学者研究发现，MAG1具有优良的免疫原性，可刺激宿主产生高滴度的抗体，不仅能为宿主提供免疫性保护，还可为弓形虫的免疫学检测提供候选蛋白。
　　 本研究旨在建立弓形虫重组MAG1蛋白间接ELISA检测体系，首先对编码弓形虫基质抗原MAG1基因进行了PCR扩增并原核表达，然后纯化MAG1重组蛋白免疫大白兔，制备抗血清，再用重组MAG1蛋白包被96孔酶免疫反应板，采用重组MAG1蛋白免疫大白兔获得的抗血清作为第一抗体，HRP酶标SPA作为第二抗体，OPD作为酶反应底物，建立基于MAG1蛋白的间接ELISA方法。
　　 测序结果表明，克隆所得的基因片段为目的基因片段。SDS-PAGE和western-blot结果表明，表达的重组蛋白为重组MAG1蛋白。该重组蛋白在用Ni2+NTA亲和层析法进行纯化时，最佳洗脱液液为含8M尿素和100mM咪唑的pH为7.4的PBS溶液。最终建立的间接ELISA方法中纯化的重组MAG1蛋白的最佳包被量应为1.5μg/孔，待检血清最佳稀释度1∶50，HRP酶标SPA的最佳稀释度为1∶5000。实验证明：该ELISA方法重复性、特异性、敏感性均较好，MAG1与阳性血清的结合是特异的。
　　 本研究成功地进行了弓形虫MAG1蛋白的原核表达并建立了ELISA方法，证实重组MAG1蛋白可用于弓形虫病的血清学检测。