牛副流感3型NP融合蛋白原核表达及r间接ELISA检测方法的建立

摘要

为原核表达牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)NX49株截短NP融合蛋白并以此建立间接ELISA检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增了BPIV3截短NP蛋白基因序列并克隆至pET-28a中进行诱导表达,纯化后产物进行Western blot分析.以重组蛋白作为包被抗原,建立并优化检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证.结果成功表达出截短的NP重组蛋白,该重组蛋白具有良好的反应原性.间接ELISA优化结果如下:抗原包被浓度为4μg/mL,37℃包被1h后4℃过夜,待检血清以1:80倍稀释37℃孵育1h,5％脱脂乳37℃封闭1h.二抗以1:5000倍稀释37℃孵育1h,TMB显色时间为15min.以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法其特异性为97.4％,敏感性为95.3％,批内、批间检测结果变异系数均小于10％.本试验成功建立检测BPIV3抗体的间接ELISA方法,该方法具有较强的特异性、良好的重复性及敏感性,为开展牛呼吸道疾病综合征的流行病学调查、实验室诊断奠定了基础.