壳聚糖/羟基磷灰石/人类重组骨形成蛋白-2复合骨诱导膜的制备及生物安全性检测

摘要

近年来随着经济不断发展，人们对生活质量的要求越来越高，种植义齿以其咀嚼效率恢复高，舒适度高等优点逐渐成为口腔修复治疗的首要选则。但是由于牙周病，缺牙时间太久等因素导致的牙槽骨吸收成为限制种植义齿推广的主要因素。未解决缺牙区骨量不足的问题，学者们正不断的探索各种骨增量的方法。引导骨再生技术(GBR)是指：利用放置于骨缺损处的膜作为屏障隔离创口，阻止其他组织长入创口影响骨愈合的一种技术，是增加种植区骨量的一种有效方法。壳聚糖(CS)学名聚氨基葡萄糖，也称几丁聚糖，是甲壳素脱乙酰基后的高分子直链型多糖。CS以其良好的成膜性、生物相容性及可降解性，成为GBR膜基质材料的研究重点。为加快种植体骨整合过程，结合羟基磷灰石(HA)是常用的壳聚糖膜改性方法。羟基磷灰石(HA)是人类等脊椎动物骨组织和牙体组织的主要成份，经其材料能诱导植入体周围骨组织的生长，并与宿主骨直接形成牢固的化学结合，因而HA被认为是常用骨组织替代材料。也是骨组织修复的常用试验材料。骨形成蛋白(BMP)是骨组织基质中的一类多功能生长因子，属于转化生长因子TGF-β超家族，是具有高度保守结构的功能蛋白，可以诱导末分化间充质细胞分化成软骨细胞和骨细胞，具有诱导骨组织形成的生物学特性，故名“骨形成蛋白”。其中BMP-2是诱导成骨活性最强的BMP成员之一。众多实验证明重组人类骨形成蛋白(rhBMP-2)可以促进骨组织的修复及改建。
　　 目的：
　　 为解决由于牙周病，缺牙时间太久等因素，导致牙槽骨吸收不能进行种植义齿修复的问题。本实验通过一种新的原位生成法制备壳聚糖/羟基磷灰石/rhBMP-2(CS/HA/rhBMP-2)复合膜，并检测其生物安全性。
　　 材料与方法：
　　 先将定量的钙离子、磷酸根离子以溶液的形式混合。然后在该溶液中其中进行壳聚糖的溶解，形成含钙、磷酸盐的壳聚糖溶液。将此液体在事先制备好的玻璃槽中流延成膜后，通过冻干的方法形成固态的成含钙盐、磷酸盐的壳聚糖膜后再在碱性溶液中形成HA。对泡碱液后的膜，用去离子水反复漂洗至PH为中性。经再次冻干，制备出含CS/HA复合膜。每片直径10mm的复合膜片滴加1.0μg的rhBMP-2，之后常温下自然干燥，制备出CS/HA/rhBMP-2复合膜。按照《中华人民共和国药物行业标准》要求，通过CS/HA/rhBMP-2复合膜浸提液大鼠经口急性毒性试验，豚鼠皮肤致敏试验，细胞毒性试验，进行药物毒性评价。
　　 结果：
　　 成功制备出CS/HA/rhBMP-2复合膜，其浸提液大鼠经口急性毒性试验未引起大鼠体重显著性下降，无中毒表现，表示该复合膜浸提液大鼠经口急性毒性试验阴性。CS/HA/rhBMP-2复合膜豚鼠皮肤致敏试验中直接接触试验及激发试验都无过敏现象。细胞毒性试验的分子滤过法CS/HA/rhBMP-2复合膜在孵育2h试验时整个乙酸纤维素滤膜染色密度无明显变化，即未出现细胞毒性；孵育24h试验时测试样品下方的乙酸纤维素滤膜染色密度减少，但没有出现未染色区，仅出现轻度细胞毒性。细胞毒性试验的琼脂覆盖法褪色指数、溶解指数均为0,细胞反应分级为0,证明其无细胞毒性。
　　 结论：
　　 原位生成法制备的CS/HA/rhBMP-2复合膜经大鼠经口急性毒性试验、豚鼠皮肤致敏试验、细胞毒性试验分别证明其无急性毒性，低致敏性，低细胞毒性。表示具有良好的生物安全性，具有作为新型GBR膜材料的潜力。