核修饰基因MTO2/TRMU调控酵母PR454突变相关的氨基糖苷类抗生素敏感性及其机制

摘要

线粒体12S rRNA基因A1555G突变是引起母系遗传性非综合症耳聋的重要原因，但是仅有A1555G突变不足以导致耳聋，耳聋表型的形成还与核修饰基因、环境因子、线粒体基因组单体型等多种因素相关。当前研究大多集中在分析环境因子或核基因等单一因素对A1555G突变的影响，而多个因素之间的协同作用机制尚不清楚。本论文以酿酒酵母为模式生物，综合分析了核修饰基因MTO2/TRMU、线粒体PR454突变（与人A1555G突变同源）与氨基糖苷类抗生素三者之间的相互作用。
　　 本实验室前期工作发现，在携带A1555G突变的淋巴细胞中，核修饰基因TRMU的G28T突变(A10S)能显著抑制细胞对氨基糖苷类抗生素的敏感性。本论文利用携带线粒体15S rRNA PR454突变的酿酒酵母菌株，构建了MTO2基因（与人TRMU基因同源）敲除模型，并分析了氨基糖苷类抗生素对携带PR454突变酵母菌株的影响以及核修饰基因MTO2的作用。研究发现MTO2基因敲除能显著抑制携带PR454突变酵母菌株对氨基糖苷类抗生素的敏感性，并深入分析了形成这一表型的机制。通过检测线粒体呼吸速率、线粒体膜电位、酵母菌株的抗生素摄入量、抗生素抗性基因表达以及能量代谢等指标，发现经抗生素处理后，携带PR454突变的酵母菌株的线粒体功能被抑制，但是MTO2基因敲除使携PR454突变酵母菌株中糖酵解的关键调控基因(已)糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸脱氢酶的表达水平显著上调，这一变化降低了酿酒酵母对线粒体功能的依赖性，并使菌株对抗生素的敏感性下降。
　　 将人TRMU cDNA转化至同时携带线粒体PR454突变与MTO2基因敲除的酿酒酵母mto2(PR)菌株中进行异源表达，结果显示TRMU基因能在酵母线粒体中特异性表达，并不同程度地恢复该菌株的线粒体功能。研究发现，与TRMU野生型转化菌株相比，TRMU A10S突变型转化菌株对氨基糖苷类抗生素的敏感性更低，而且TRMUA10S突变型转化菌株的线粒体功能几乎不受抗生素影响。
　　 本论文发现核修饰基因MTO2/TRMU能够调控线粒体PR454(A1555G)突变相关的氨基糖苷类抗生素敏感性，并系统研究了其分子机制。研究结果为阐明人TRMU基因调控A1555G突变相关的抗生素敏感性提供了借鉴，并可为研究核基因、线粒体基因、环境因素三者之间的相互作用提供参考。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述：线粒体DNA突变、核修饰基因及环境因素的相互作用

1．1 引言

1．2 线粒体DNA致病突变

1．2．1 线粒体基因病

1．2．2 A1555G突变与非综合症耳聋

1．3 氨基糖苷类抗生素的耳毒性

1．3．1 氨基糖苷类抗生素结构与耳毒性

1．3．2 氨基糖苷类抗生素与rRNA的相互作用

1．4 核修饰基因对A1555G突变表型表达的影响

1．4．1 tRNA修饰与TRMU的基本功能

1．4．2 TRMU基因修饰A1555G表型表达

1．4．3 TRMU基因突变与急性肝衰竭

1．4．4 A1555G突变的其他核修饰基因

1．5 研究A1555G突变的酿酒酵母模型

1．6 线粒体基因病的防治与干预

1．7 结论

第二章 MTO2敲除抑制携带PR454突变酵母对氨基糖苷类抗生素的敏感性

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果与分析

2．3．1 酵母线粒体PR454突变与人A1555G／C1494T突变同源

2．3．2 MTO2敲除抑制携带PR454突变酵母对新霉素的敏感性

2．3．3 MTO2敲除抑制携带PR454突变酵母对新霉素敏感性的机制研究

2．3．4 MTO2敲除抑制携带PR454突变菌株对4，5-氨基糖苷类抗生素的敏感性

2．3．5 mto2(PR)菌株的巴龙霉素依赖性

2．4 讨论

2．4．1 PR454突交与氨基糖苷类抗生素敏感性

2．4．2 MTO2调控PR454突变相关抗生素敏感性的机制

2．4．3 mto2(PR)菌株的巴龙零素依赖性

2．5 结论

第三章 人TRMU cDNA转化菌株的抗生素敏感性研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 实验结果与分析

3．3．1 TRMU A10S突变抑制携带PR454突变酵母的新霉素敏感性

3．3．2 Trmu蛋白质在酵母线粒体中特异性表达

3．3．3 TRMU A10S突变抑制携带PR454突变菌株新零素敏感性的机制研究

3．3．4 TRMU A10S突变抑制携带A1555G突变淋巴细胞的抗生素敏感性

3．4 讨论

3．4．1 TRMU A10S突变抑制线粒体突变相关的抗生素敏感性

3．4．2 酿酒酵母作为模式生物研究线粒体耳聋的优劣

3．4．3 酵母MTO2敲除与人TRMU A10S突变的异同

3．4．4 TRMU A10S突变抑制A1555G突变细胞抗生素敏感性的启示

3．5 本章小结

参考文献

附录Ⅰ：主要试剂的配制方法

附录Ⅱ：英文缩略词

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