核修饰基因MTO1调控携线粒体15S rRNA C1409G突变酵母对氨基糖苷类抗生素的敏感性及其机制研究

摘要

线粒体是细胞内氧化磷酸化形成ATP的主要场所，是生命活动的能量来源，对细胞生命活动至关重要。线粒体是由核基因和线粒体基因共同编码的，核基因和线粒体基因的突变都会影响到线粒体的功能。线粒体的功能异常会导致细胞正常活动障碍，进而引发一系列疾病。对线粒体疾病的研究具有很重要的社会意义。
　　 核修饰基因MTO1，是进化上高度保守的线粒体蛋白，参与与线粒体tRNA摇摆位置修饰相关的cmnm5s2U的5-羧甲基氨甲基基团的生物合成。酵母的15SrRNAC1409G突变是人耳聋相关的12S rRNAA1555G突变的同源突变。A1555G突变相关的耳聋的表型决定于核基因、线粒体基因和环境因素间的相互作用，本文把核修饰基因、线粒体突变和抗生素三者作为一个整体来系统研究。以酵母作为模式生物，对携带野生或敲除的核修饰基因MTO1、和/或线粒体15S rRNAC1409G突变的酵母菌株系列，通过表型鉴定、机制分析等多种实验方法，研究抗生素胁迫环境下，核修饰基因调控线粒体突变的作用。
　　 在氨基糖苷类抗生素作用下，核修饰基因MTO1野生或敲除、线粒体基因野生的菌株可以良好生长，说明MTO1敲除与否不影响线粒体野生型酵母在氨基糖苷类抗生素作用下的生长。而核为野生型、线粒体为突变型的菌株几乎不能存活，说明携带15S rRNA C1409G突变的菌株对抗生素非常敏感，生长受到明显抑制。核基因MTO1敲除、线粒体携带15S rRNA C1409G突变的菌株，其因核基因突变和线粒体突变导致的呼吸缺陷与抗生素对其的抑制作用没有发生协同效应，反而使该菌株对抗生素的敏感性显著降低，说明MTO1的敲除调控了携带15S rRNA C1409G突变的酵母对氨基糖苷类抗生素的敏感性。
　　 从线粒体的氧耗水平、膜电位和转录水平分析线粒体的功能，携带15S rRNAC1409G突变的菌株在新霉素作用下线粒体功能低下。核和线粒体均为突变型的菌株的线粒体功能显著低于核野生、线粒体突变的菌株，不是因为基因型的差异造成线粒体功能的变化而出现表型;分析能量代谢相关的糖酵解通路，核和线粒体均为突变型的菌株在新霉素作用下的糖酵解关键酶的表达，在RNA水平和蛋白水平上都显著高于核野生、线粒体突变的菌株。核基因MTO1的敲除可能引起了糖酵解通路的变化，加速产能弥补呼吸缺陷造成的能量不足，从而产生这样的表型。分析菌株产生氨基糖苷类抗生素抗性的机制，菌株间不存在抗生素摄入量和氨基糖苷类抗生素修饰酶的差异。分析多种氨基糖苷类抗生素的作用，4，5-取代的氨基糖苷类抗生素具有和新霉素一致的表型。酵母中15S rRNA1477-1583(1409-1491)碱基的配对与否对酵母菌株对新霉素的敏感性非常重要，不配对时菌株形成类似人A1555G的结构，表现出对新霉素的敏感性，而配对后其对新霉素不敏感。将MTO1所在通路的MTO1、MTO2、MSS1系列菌株比较分析，核和线粒体均为突变型的菌株在新霉素作用下有不同程度的生长恢复，且糖酵解途径的己糖激酶的蛋白水平存在差异。分析和MTO1相互作用的基因，提示MTO1敲除可能通过影响cAMP的变化激活糖酵解通路。
　　 本论文从三个层次系统的研究了核基因、氨基糖苷类抗生素、线粒体基因对携带15S rRNA C1409G酵母的影响，对于了解人12S rRNAA1555G突变是如何受核基因、线粒体基因、环境因素共同影响而出现临床表现多样性的机制有一定的帮助。可以考虑在以后检测线粒体突变的同时也检测核基因，为个性化治疗提供理论依据。

目录

声明

致谢

摘要

1 绪论

2 文献综述

2．1 线粒体与线粒体疾病

2．1．1 线粒体

2．1．2 线粒体疾病

2．1．3 线粒体耳聋

2．2 线粒体核糖体与线粒体蛋白质的翻译

2．2．1 核糖体的结构与功能

2．2．2 核糖体A位点的重要性

2．2．3 线粒体12S rRNA的A1555G突变

2．3 MTO1基因与tRNA修饰

2．3．1 tRNA的摇摆修饰

2．3．2 cmnm5s2U通路概述

2．3．3 MTO1基因的功能和相关的研究

2．4 氨基糖苷类抗生素

2．4．1 氨基糖苷类抗生素的结构

2．4．2 氨基糖苷类抗生素的作用机理

2．4．3 氨基糖苷类抗生素的耳毒性

2．5 酿酒酵母可以作为研究线粒体疾病的模型

2．5．1 酵母基因与人类基因具有高度的序列同源性和进化上的保守性

2．5．2 酿酒酵母在分子研究上的优点

2．5．3 用酿酒酵母研究线粒体疾病的可行性和优点

3 实验材料与方法

4 实验结果

4．1 MTO1基因编码产物以及C1409G突变所在rRNA的结构分析

4．1．1 MTO1在人和酵母中具有高度的序列回源性和功能保守性

4．1．2 酵母中MTO1编码蛋白定位于线粒体中

4．1．3 人A1555G突变与酵母C1409G突变所在rRNA的二级结构

4．2 MTO1敲除抑制携带15S rRNA C1409G突变酵母对新霉素的敏感性

4．2．1 MTO1系列菌株的鉴定

4．2．2 MTO1系列菌株在新霉素处理下出现了显著的敏感性差异

4．3 MTO1敲除影响携带15S rRNA C1409G突变的酵母对新霉素敏感性的机制研究

4．3．1 MTO1系列菌株基因型的差异在抗生素处理前后对线粒体功能的影响

4．3．2 MTO1系列菌株基因型的差异在抗生素处理前后对能量代谢的影响

4．3．3 MTO1系列菌株基因型的差异在抗生素处理前后对菌株抗性机制的影响

4．4 MTO1系列菌株的表型在氨基糖苷类抗生素作用下的表型

4．4．1 MTO1菌株在4，5-取代的氨基糖苷类抗生素平板上的表型

4．4．2 MTO1菌株在4，6-取代的氨基糖苷类抗生素平板上的表型

4．5 15S rRNA G1583U突变会影响C1409G突变的作用

4．6 cmnm5s2U通路的MTO1、MTO2、MSS1基因比较

4．6．1 MTO1、MTO2、MSS1菌株在新霉素作用下的表型比较

4．6．2 MTO1突变激活糖酵解通路的可能机制

4．7 本章总结

5 讨论

参考文献

附录1 实验仪器、药品及试剂配制

附录2 缩略语索引

作者简历