家蚕后部丝腺差异蛋白组学及microRNA表达谱研究

摘要

作为鳞翅目昆虫的典型代表，家蚕拥有其他昆虫无法替代的经济性状;而更重要的是，作为仅次于果蝇的第二大模式昆虫，它又几乎囊括了其他昆虫的所有生物性状。众多的特点不仅造就了一个可持续发展的经济产业，而且也吸引了一大批蚕桑科研领域之外的多学科人员的共同参与，使得近几年来蚕桑科研领域的蓬勃发展，取得了令人瞩目的学术成果。家蚕基因组计划的顺利完成，为进一步在后基因组时代中的研究提供了关键的理论基础和技术平台。后基因组时代的研究内容有很多，对基因组序列进行准确的注释是至关重要的任务之一，而且事实证明，生物体以一个复杂的系统，其基因的表达受到很多因子的调控，使得其表达水平与蛋白的表达水平存在一定的开差。要解决这一问题，我们不仅要依赖于对蛋白质的研究，而且也要深入探索其他调控因子的作用，比如microRNA(miRNA)。本文就有关家蚕后部丝腺的蛋白质组和miRNA表达谱方面的工作进行了初步研究，取得的主要的研究结果如下:
　　 1、高温胁迫下家蚕后部丝腺差异蛋白质组分析
　　 我们用比较蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术研究了高温胁迫下家蚕原种和杂交种后部丝腺蛋白质表达差异。结果发现，在获得的所有蛋白点中，有82.07％的蛋白点显示假性效应，6.17％显示超显性，11.76％的蛋白点为显性不足。我们用质谱鉴定了15个差异表达的蛋白点，其中，4个点包括热激蛋白和抑制素蛋白直接与热激应答有关，其余11个蛋白点在蚕丝的合成中发挥着重要作用。我们还鉴定了9个蛋白与蛋白质磷酸化有关。根据基因注释和代谢途径分析，这九个蛋白在高温胁迫后的信号转导过程中发挥着重要功能。在三个品种中大部分与丝腺合成有关的蛋白随着时间变化其表达被抑制，而与应激类相关蛋白则呈现上调趋势。而且，与原种比较，杂交种中鉴定的大部分蛋白呈现超显性或显性不足的状态。结果表明高温刺激会影响后部丝腺中与热激和蚕丝合成相关蛋白的表达，更重要的是，在原种和杂交种中差异表达的蛋白在一定程度上揭示了杂种优势的存在。
　　 2、miRNA识别软件的筛选
　　 虽然借助高通量测序可以发现大量的候选miRNAs，但也会产生大量的真假难辨的数据从而给新miRNAs的鉴定带来很大的挑战。基于前人的研究，三种基于支持向量机的软件可以有效地去除一些假阳性的miRNAs。由于这些软件的设计大都建立在人类已知miRNA前体的结构特征，所以有必要对人类和昆虫miRNAs前体特征进行对比，并比较它们对昆虫miRNAs的预测性能，进而挑选出最适合昆虫的软件。我们利用现有的数据库和生物信息学工具，系统地分析了人类miRNA前体和昆虫前体的特征差异以及昆虫24个不同种类之间的结构特征。结果表明，人类和昆虫miRNA前体的核苷酸组成，序列长度，核苷酸偏好和二级结构的特点是不同的。随后，借助三个现有的支持向量机的miRNA识别程序对这些已知的miRNA进行评分，以此来判断miRNA识别软件的性能高低。结果表明，2，633条昆虫前体中有2，229条被mirident分类器成功识别，比例高达84.66％，高于triplet-svm(72.50％)和(72.65％) pmirp。我们分别用软件检测每一个现有的昆虫物种，结果发现有四个物种，包括家蚕，果蝇，蜂和赤拟谷盗，获得了较低的成绩。特别是，与其他物种相比，家蚕的识别率最低，平均MFE指数也最小(0.73)。总的来说，这些结果为我们了解昆虫miRNA前体的特异性和多样性提供了线索，也为进一步开发出针对昆虫前体特征的miRNA识别软件奠定了基础。
　　 3、家蚕后部丝腺miRNAs表达谱分析
　　 我们用solexa技术对六个小RNA文库进行了深度测序，并用DASP方法检测到293个已知家蚕miRNAs，它们分成66个家族。从物种保守性来看，有40个家族保守在昆虫和其他物种间，剩下的26个家族只在家蚕上发现。另外，根据系统发育分析，这些miRNAs分布在14个从无脊椎动物到脊椎动物的物种上，为进一步研究动物的进化提供了系统发育标记和进化信号。同时，我们分析了不同产丝量品种之间miRNAs的表达差异，结果发现多丝量品种J1中下调表达的miRNAs远远多于裸蛹品种R1。而对两个不同发育时期的家蚕进行分析表明，丝腺细胞快速发育期比前期也同样拥有较多的下调miRNAs。两个独立实验分别印证了丝蛋白基因的表达可能受到了miRNAs的调控，从而造成丝心蛋白表达量的变化。我们随后采用mireap对未注释序列进行新miRNA的预测得到1，373条候选miRNAs。同时利用本实验筛选出的miRNA前体检测软件mirident程序，成功地从六个文库的候选miRNA中检验出414条非冗余新miRNA和432条前体序列，其中有50对miRNA/miRNA*复合体，结果大大丰富了家蚕miRNA数据库。借助生物信息学软件，我们对差异表达的miRNA进行靶标预测、GO分类和KEGG分析。我们发现，多丝量品种下调miRNAs对应的KEGG的靶基因数量明显高于上调表达的miRNAs。这些通路涉及范围较广，包括细胞凋亡，精氨酸脯氨酸代谢，氨基酸-tRNA生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，氨基酸和核酸糖代谢等。通过对以丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路的分析，结果表明下调miRNA对应靶基因更多地参与丙氨酸代谢途径，结茧蚕比裸蛹可能要合成更多的丙氨酸来促进丝腺细胞的发育。我们推测多丝量家蚕后部丝腺miRNAs的下调表达有利于家蚕囤积与丝蛋白合成相关的物质，储存能量，来促进蚕茧高产。
　　 4、家蚕后部丝腺miRNA表达谱芯片分析
　　 为了更全面的验证五龄第三天家蚕后部丝腺miRNA表达谱，我们定制了一个囊括家蚕数据库，果蝇数据库，最近发表文章以及本实验预测的miRNAs的全方位探针，并最终鉴定出333条miRNAs，包含家蚕已知miRNA213条和120条新miRNA，其中，在新miRNAs中发现有13条保守在果蝇中。我们对芯片的结果进行重复性检测以及与solexa测序相关性分析，发现芯片重复性高，与solexa相比更适合miRNAs的定量分析。随后，我们分析了秋丰和白玉雌雄以及品种之间的差异性，结果表明无论性别还是品种，它们的miRNAs表达差异在总体水平上不显著，这可能与秋丰、白玉二者产丝性状相差很小有关。
　　 本论文所取得的成果为研究生物在高温胁迫条件下的抗逆性以及杂种优势及抗性机理提供理论依据，为丰富家蚕miRNAs数据库提供了资源储备，同时也为研究后部丝腺miRNAs在五龄期间蚕丝合成过程发挥的作用提供了参考。

目录

声明

致谢

摘要

绪论

1．1 研究背景

1．2 蛋白质组学研究进展

1．2．1 蛋白质组学研究方法概论

1．2．2 定量蛋白质组学

1．2．3 翻译后修饰(Post-translational modifications)

1．3 MicroRNA的研究现状

1．3．1 miRNA的发现和起源

1．3．2 miRNA的功能

1．3．3 miRNA的检测方法

1．3．4 miRNA靶基因的预测

1．4 本研究的内容、目的意义和技术路线

第2章 家蚕后部丝腺蛋白质组学研究

2．1 引言

2．2 研究目的

2．3 研究内容

2．4 材料与方法

2．4．1 样品制备

2．4．2 主要试剂

2．4．3 主要仪器

2．4．4 实验方法

2．5 结果

2．5．1 家蚕后部丝腺蛋白表达谱分析

2．5．2 质谱鉴定和生物信息学分析

2．5．3 差异蛋白分析

2．6 讨论

2．7 小结

第3章 miRNA鉴别软件筛选

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 miRNA前体序列下载及处理

3．2．2 三种基于支持向量机(SVM)的分类器

3．2．3 统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 人类和昆虫miRNA前体特征比较

3．3．2 整体对比和测试

3．3．3 24个物种内部差异分析

3．4 小结

第4章 家蚕后部丝腺miRNA表达谱分析

4．1 引言

4．2 研究目的

4．2．1 实验材料

4．2．2 方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 小RNA文库Solexa测序

4．3．2 miRNA的检测和保守性分析

4．3．3 miRNAs表达谱分析

4．3．4 预测新miRNAs

4．3．5 差异miRNAs靶基因预测

4．4 小结

第5章 家蚕后部丝腺miRNA表达谱芯片构建与分析

5．1 材料与方法

5．1．1 生物材料

5．1．2 总RNA提取

5．1．3 实验方法

5．2 结果与讨论

5．2．1 家蚕后部丝腺miRNAs表达谱芯片的构建

5．2．2 家蚕后部丝腺miRNAs检测

5．2．3 实验重复性分析

5．2．4 家蚕五龄第三天miRNAs表达差异分析

5．3 小结

第6章 全文总结及创新点

6．1 全文总结

6．2 主要问题

6．3 创新点

攻读学位期间发表的学术论文

参考文献

附录1 414条新miRNAs及表达量

附录2 新miRNAs前体序列比较

附录3 芯片验证的miRNAs