带鱼蛋白酶解制备抗氧化活性肽的研究

摘要

人体内的自由基水平失衡会造成机体各种不可逆的氧化性损伤，加速机体的衰老并诱发各种疾病，外源性抗氧化剂可以帮助人体维持自由基的平衡。带鱼蛋白质含量丰富，营养价值极高，可作为制取抗氧化肽的优质原料。长期以来，带鱼由于加工技术水平和回收手段落后，造成资源利用率低、浪费严重等现象，同时由于大量营养成分流失，更造成了环境的污染。本文以带鱼为原料，优化带鱼蛋白的酶解条件，评价了酶解物的抗氧化特性，并采用多种分离技术方法对抗氧化肽进行分离纯化，为抗氧化肽的制备提供新途径。 采用Alcalase2.4L酶解带鱼蛋白，通过可控酶解技术结合响应面试验分析，正交试验分析优化带鱼蛋白的酶解条件，制备出具有高抗氧化活性的酶解物。研究结果表明:酶解液清除DPPH自由基的最佳条件为酶解温度48℃，加酶量1.65％，酶解时间3.80h，水料比1∶3，清除率达到60.13％;清除·OH自由基的最佳条件为酶解温度50℃，加酶量1.60％，酶解时间5.50h，料液比1∶2，清除率为58.73％;还原力达最大值的反应条件为酶解温度50℃，加酶量2.00％，酶解时间5.00h，水料比1∶6，A700nm达到3.13;清除ABTS+自由基的最佳条件为酶解温度50℃，加酶量0.60％，酶解时间120min，料液比1∶20，清除率为69.58％;清除O2-·自由基的较优条件为加酶量3.20％，酶解温度50℃，酶解时间3.00h，料液比1∶3，清除率为47.31％ 研究了Alcalase2.4L酶解带鱼蛋白的动力学模型。研究结果表明:在酶解温度50℃，pH8.0的条件下，酶解速率方程和水解度方程分别为:r=(2.2852e0/s0+0.1934)·e-25.3981(DH), DH=0.0390ln[1+(58.0400e0/s0+4.9120)t]，蛋白酶失活常数kd=57.410h-1。并验证该动力学模型具有很好的实际应用价值。 采用离心超滤、离子交换层析、凝胶层析、RP-HPLC多步分离纯化带鱼抗氧化肽。得到抗氧化性最高的组分④-Ⅳ对DPPH自由基清除率为76.34％，比分离前提高了27％，表明分离纯化能明显提高带鱼抗氧化肽的抗氧化能力。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 抗氧化肽的研究进展

1．2．1 抗氧化肽的来源

1．2．2 抗氧化肽的制备方法

1．3 抗氧化肽的评价方法

1．3．1 清除自由基的能力

1．3．2 抑制脂质过氧化的能力

1．3．3 螯合金属离子的能力

1．3．4 协同抗氧化能力

1．4 影响抗氧化能力的因素

1．4．1 蛋白酶

1．4．2 底物蛋白

1．4．3 pH值

1．4．4 温度

1．4．5 水解度

1．5 抗氧化肽的分离纯化

1．5．1 超滤法

1．5．2 离子交换层析

1．5．3 凝胶层析

1．5．4 反相高效液相色谱(RP-HPLC)

1．6 带鱼及其营养价值

1．7 本课题的研究背景及研究意义

1．8 本课题的研究内容

第二章 带鱼蛋白酶解物清除DPPH自由基能力的研究

2．1 引言

2．2 材料与仪器

2．2．1 主要材料

2．2．2 主要仪器

2．3 实验方法

2．3．1 带鱼蛋白酶解液的制备

2．3．2 酶种类的选择

2．3．3 蛋白质水解度的测定

2．3．4 酶解物DPPH自由基清除能力的测定

2．3．5 响应面分析因素及水平表

2．4 结果与讨论

2．4．1 酶种类的选择

2．4．2 酶解时间对DPPH自由基清除率、水解度的影响

2．4．3 酶解温度对DPPH自由基清除率、水解度的影响

2．4．4 加酶量对DPPH自由基清除率、水解度的影响

2．4．5 响应面优化结果及分析

2．5 结论

第三章 带鱼蛋白酶解物还原力和·OH自由基清除能力的研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 主要材料

3．2．2 主要仪器

3．3 实验方法

3．3．1 带鱼蛋白酶解液的制备

3．3．2 还原力的测定

3．3．3 酶解物羟基自由基清除能力的测定

3．3．4 正交试验因素水平表

3．4 结果与讨论

3．4．1 加酶量对羟基自由基清除率、还原力的影响

3．4．2 温度对羟基自由基清除率、还原力的影响

3．4．3 酶解时间对羟基自由基清除率、还原力的影响

3．4．4 水料比对羟基自由基清除率、还原力的影响

3．4．5 正交实验

3．5 结论

第四章 带鱼蛋白酶解物清除ABTS+和O2-·自由基能力的研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 主要材料

4．2．2 主要仪器

4．3 实验方法

4．3．1 带鱼蛋白酶解液的制备

4．3．2 酶解液ABTS+自由基清除能力的测定

4．3．3 酶解液O2-·自由基清除能力的测定

4．3．4 正交试验因素水平表

4．4 结果与讨论

4．4．1 酶解时间对ABTS+自由基、O2-·自由基清除率的影响

4．4．2 加酶量对ABTS+自由基、O2-·自由基清除率的影响

4．4．3 酶解温度对ABTS+自由基、O2-·自由基清除率的影响

4．4．4 正交实验

4．5 结论

第五章 Alcalase酶解带鱼蛋白动力学模型研究

5．1 引言

5．2 材料与仪器

5．2．1 主要材料

5．2．2 主要仪器

5．3 实验方法

5．3．1 带鱼蛋白酶解液的削备

5．3．2 蛋白质水解度的测定

5．4 结果与讨论

5．4．1 带鱼蛋白水解动力学模型

5．4．2 初始蛋白浓度对水解度的影响

5．4．3 初始酶用量对水解度的影响

5．4．4 动力学参数确定及动力学模型

5．4．5 Alcalase酶失活常数的确定

5．4．6 酶解动力学模型验证

5．5 结论

第六章 带鱼蛋白抗氧化肽的分离纯化研究

6．1 引言

6．2 材料与仪器

6．2．1 主要材料

6．2．2 主要仪器

6．3 实验方法

6．3．1 带鱼蛋白酶解液的制备

6．3．2 酶解物DPPH自由基清除能力的测定

6．3．3 多肽含量的测定

6．3．4 离心超滤分离抗氧化肽

6．3．5 离子交换层析分离抗氧化肽

6．3．6 凝胶层析分离抗氧化肽

6．3．7 RP-HPLC分离抗氧化肽

6．4 结果与讨论

6．4．1 离心超滤分离抗氧化肽

6．4．2 离子交换层析分离抗氧化肽

6．4．3 凝胶层析分离抗氧化肽

6．4．4 RP-HPLC分离抗氧化肽

6．5 结论

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

作者简介